Préparation, Purification et l’utilisation de Liposomes contenant de l’acide gras

L’objectif global de cette procédure est de préparer, de purifier et d’utiliser des liposomes composés en partie ou en totalité d’acides gras. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie synthétique et en études sur l’origine de la vie, telles que la définition de cellules minimales et la construction de protocellules artificielles. Le principal avantage de ce protocole est qu’il présente un moyen facile et peu coûteux de produire des vésicules d’acides gras monodispersés à haut rendement et de les manipuler dans une gamme de conditions expérimentales.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car les vésicules d’acides gras sont plus délicates que les vésicules phospholipidiques, en particulier en présence de Pour préparer de minces films de lipides séchés, utilisez des seringues étanches aux gaz pour transférer une quantité spécifique de lipides dans le chloroforme dans un flacon en verre. Évaporez le chloroforme sous un courant d’azote ou d’argon dans la hotte. Soumettez la couche mince obtenue à l’aspirateur domestique pendant au moins deux heures pour éliminer tout chloroforme résiduel.

À ce stade, le lipide pourrait être laissé sous vide pendant la nuit. Pour réhydrater les vésicules, pipetez 250 microlitres de tampon d’hydratation dans un tube vide, puis ajoutez 1,875 microlitres d’hydroxyde de sodium à 10 molaires pour une base finale de 75 millimolaires. Transférez la solution dans la fine pellicule de lipide sec pour former des vésicules avec la concentration totale d’acides gras de 0,15 molaire, puis utilisez un vortex à grande vitesse pour vortex le mélange résultant pendant quatre à cinq secondes.

Agitez le mélange de tampon lipidique sur un agitateur rotatif à basse vitesse pour le réhydrater pendant la nuit. Pour générer des vésicules de taille uniforme, utilisez une pince à épiler pour appliquer un support de filtre sur chaque surface interne des orifices de seringue de l’extrudeuse de liposomes. Mouillez chaque support de filtre avec 250 millimolaires de Tris-HCL pH 8.

À l’aide d’une pince à épiler, appliquez une gravure sur une piste sur une membrane en polycarbonate de 100 nanomètres sur l’un des joints toriques de l’extrudeuse et des supports de filtre. En prenant soin de ne pas déchirer ou perforer la membrane, poussez doucement la membrane dans le joint torique afin d’établir un bon contact entre les deux surfaces. Ensuite, assemblez l’extrudeuse en prenant soin de ne pas déplacer la membrane et les supports du filtre.

Remplissez une seringue d’extrudeuse avec environ 0,5 millilitre de Tris-HCL pH 8 de 250 millimolaires. Insérez cette seringue dans un côté de l’extrudeur. Insérez une seringue vide de l’autre côté de l’extrudeuse.

Poussez lentement le piston et le tampon contenant la seringue à la main et vérifiez que la résistance est ressentie, indiquant que la membrane gravée est en place et intacte. Il est utile de pratiquer cette étape sans membrane en place afin d’évaluer le niveau de résistance attendu. Retirez et videz les deux seringues.

Il n’est pas nécessaire de nettoyer les deux seringues à ce stade car elles contiennent un tampon de composition identique à la préparation de liposomes. Ensuite, chargez la préparation liposomale dans l’une des deux seringues. Remontez l’extrudeuse avec la seringue contenant l’échantillon de vésicule sur le côté gauche et une seringue vide sur le côté droit.

Ensuite, poussez très lentement à la main le piston de la seringue contenant l’échantillon de vésicule. Observez attentivement la seringue sur le côté droit de l’extrudeuse. Le tampon transparent pénètre d’abord dans le côté droit de l’extrudeuse en raison du volume mort interne de l’extrudeur, suivi d’un petit panache de liposomes extrudés.

Arrêtez immédiatement de pousser à ce stade. Retirez la seringue sur le côté droit de l’extrudeuse et jetez la solution. Replacez la seringue sur le côté droit de l’extrudeuse et extrudez jusqu’à ce que la seringue gauche soit vide.

Inversez l’orientation de l’extrudeuse et répétez le remplacement de la seringue. Continuez pendant le nombre de cycles souhaité. Un nombre impair est toujours utilisé pour s’assurer que les liposomes ne sont pas prélevés dans la seringue contenant à l’origine des liposomes non extrudés.

Enfin, versez doucement le contenu de la seringue droite dans un tube Eppendorf. Placez le tube sur un agitateur rotatif à basse vitesse pendant environ 30 minutes. Pour préparer la phase mobile de purification des vésicules, préparez cinq millilitres de tampon d’hydratation Tris-HCL pH 8 de 250 millimolaires dans un tube Falcon de 15 millilitres.

Ajoutez ensuite 37,5 microlitres d’hydroxyde de sodium 10 molaires au tampon d’hydratation. Pipetez 235 microlitres d’acide oléique pur dans le tube Falcon, ce qui permet d’obtenir une solution vésiculaire avec 0,15 molaire de lipides totaux. Ensuite, utilisez un vortex à grande vitesse pour vortex le mélange pendant quatre à cinq secondes.

Ensuite, faites culbuter sur un agitateur rotatif à basse vitesse pendant au moins deux heures. La préparation lipidique peut être laissée toute la nuit sur le shaker rotatif à ce stade. Filtrez la phase mobile à travers une unité de filtre à seringue de 0,22 micron pour éliminer tout agrégat potentiel.

Pour purifier les vésicules, préparez d’abord la colonne Sepharose 4B comme indiqué dans le protocole de texte et fixez-la sur le support de l’autoclave. Connectez ensuite l’extrémité de la colonne avec le connecteur du robinet d’arrêt et connectez le tube au collecteur de fractions. Ajoutez une autre portion de tampon pour rincer le tube et fermez le robinet d’arrêt lorsque le niveau de liquide dans la colonne s’approche du haut de la résine.

Ensuite, appliquez les vésicules extrudées sur le dessus de la résine à l’aide d’une pipette de 200 microlitres en prenant soin d’appliquer la préparation des vésicules aussi uniformément que possible sur la résine sans toucher le lit de résine ou la paroi de la colonne. Ouvrez le robinet d’arrêt pour commencer l’écoulement et commencez à collecter les fractions dans une plaque de 96 puits. Appliquez la phase mobile de purification des vésicules sur le dessus du lit de résine en portions de 0,5 à un millilitre au fur et à mesure que le tampon s’épuise, en prenant soin de ne pas laisser le lit de résine se dessécher.

Ensuite, collectez l’éluant en fractions de cinq gouttes, en recueillant au moins 36 puits. Pour caractériser les fractions de purification, lire la plaque à 96 puits sur un lecteur de plaques. Tracez les données de fluorescence résultantes en fonction de la fluorescence en nombre de fractions.

Les vésicules éluent en premier, suivies de la fraction non encapsulée. Lors de l’utilisation de magnésium ligandé, prémélanger le chlorure de magnésium et le citrate de potassium au rapport spécifié dans un tampon Tris-HCL pH 8 de 250 millimolaires. Ici, un rapport de un à quatre est utilisé pour les vésicules d’acide oléique stables.

N’oubliez pas de toujours prémélanger la solution de magnésium et de ligand. N’exposez jamais les vésicules d’acides gras au magnésium non chélaté seul. Ajouter la solution de citrate de magnésium prémélangée à l’échantillon de vésicules.

Agitez brièvement le mélange. Laissez l’échantillon de vésicule sur un gobelet pendant au moins 30 minutes avant la repurification, comme décrit dans le protocole textuel. Assurez-vous d’ajouter la même concentration de magnésium et de citrate que dans l’échantillon de vésicule à la phase mobile de repurification.

Mélangez la solution de magnésium avec des vésicules purifiées comme décrit dans le protocole de texte pour initier la réaction d’auto-clivage. Pour les études cinétiques, prélever 100 microlitres du mélange à chaque point temporel et repurifier directement cette aliquote à travers une colonne d’exclusion de taille Sepharose 4B avec 250 millimolaires de Tris-HCL pH 8 comme phase mobile. Récupérez la fraction vésiculaire.

Préparez l’échantillon de charge d’ARN comme décrit dans le protocole texte. Placez le gel d’urée 15 % TBE coulé dans le commerce dans la boîte de gel et remplissez la boîte de gel avec 1X tampon de gel TBE. Après avoir chauffé les échantillons sur un bloc chauffant à 80 degrés Celsius pendant une minute, chargez cinq microlitres de chaque échantillon par puits.

Faites fonctionner le gel avec une tension constante de 200 volts pendant environ une heure. Enfin, scannez le gel et quantifiez-le à l’aide d’un programme d’analyse. Pour démontrer que l’ARN peut fonctionner à l’intérieur des protocellules, l’auto-clivage du ribozyme de la tête de marteau avec le brin de substrat marqué par fluorescence a été utilisé comme réaction catalytique de l’ARN modèle.

Cette réaction nécessite du magnésium libre pour faciliter la catalyse. Par conséquent, des vésicules monooléates d’acide oléique/glycérol ont été utilisées car elles sont stables en présence de cinq millimolaires de magnésium. La réaction d’auto-clivage du ribozyme de la tête de marteau peut être surveillée par électrophorèse sur gel.

Après avoir quantifié l’image de la page, un ajustement linéaire du logarithme népérien du rapport entre la quantité de substrat restante à un point donné et la quantité initiale de substrat en fonction du temps est généré. Ce graphique peut être utilisé pour le calcul de l’activité des ribozymes. Une fois maîtrisés, les liposomes d’acides gras avec colorant encapsulé ou ARN peuvent être préparés et purifiés en 24 heures.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de former des liposomes d’acides gras dans la bonne plage de pH et de maintenir la concentration totale de lipides au-dessus de la concentration critique d’agrégation du lipide pour éviter la dissolution des vésicules. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer les liposomes d’acides gras et de les utiliser pour héberger des réactions biochimiques.