توصيف الأغشية الحيوية المائية مع التدفق الخلوي

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال العلوم البيئية ، مثل آثار التلوث الكيميائي أو تغير المناخ في النظم الإيكولوجية المائية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن جميع الخطوات الفردية بسيطة وسريعة التنفيذ. على الرغم من أن تركيز الإجراء ينصب على توصيف الأغشية الحيوية ذاتية التغذية ، إلا أنه يمكن استخدامه أيضا لتوصيف الأغشية الحيوية غير المتجانسة والكشف عن ملوثات الجسيمات مثل اللدائن الدقيقة.

للبدء ، حدد موقعا لأخذ العينات المائية حيث تنمو الأغشية الحيوية ، وعادة ما تكون هذه أجزاء ضحلة من الجداول ذات تدفق المياه البطيء إلى المتوسط ومجاري الجداول الصخرية. إذا لم يكن الموقع يحتوي على سطح كاف لربط الأغشية الحيوية ، فيمكنك استخدام ركائز اصطناعية حيث يمكن أن تنمو الأغشية الحيوية. قم بقياس الظروف البيئية في موقع أخذ العينات باستخدام أدوات محمولة لقياس الموصلية ودرجة الحموضة ودرجة حرارة الماء وشدة الضوء فوق سطح الأغشية الحيوية المراد أخذ عينات منها مباشرة.

باستخدام القفازات الواقية ، اجمع الأحجار المتشابهة في الحجم والشكل والنوع من كل موقع. يجب جمع الحجارة من المناطق المعرضة لظروف تدفق وإضاءة مماثلة. بالإضافة إلى جمع عينات الأغشية الحيوية وقياس ظروف النمو في الموقع ، احصل على عينات من المياه لقياس معلمات كيمياء المياه.

لمعالجة عينات الأغشية الحيوية ، قم أولا بتصفية 15 مل من مياه التيار من الموقع من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. بعد ذلك ، استخدم فرشاة أسنان ناعمة لإزالة الأغشية الحيوية من الركيزة حتى يتم تعليقها تماما في قارورة. قم بإصلاح عينات الأغشية الحيوية باستخدام 0.01٪ بارافورمالدهايد و 0.1٪ جلوتارالديهايد.

نقل عينات فرعية من الأغشية الحيوية إلى مجهر ضوئي. انتقل إلى التكبير المناسب لعينتك وحدد الأنواع الموجودة في عينات الأغشية الحيوية. تحضير الثقافات للأنواع الفردية.

قم بزراعتها باستمرار باستخدام ظروف بيئية مماثلة للبيئة التي تم أخذ عينات الأغشية الحيوية منها. بمجرد نموها ، قم بتفريق الخلايا عن طريق صوتنها لمدة خمس إلى 10 ثوان عند 45 كيلو هرتز. ضع الخلايا المشتتة في طبق 96 بئر.

بمجرد التشتت ، قم بتسجيل أطياف الامتصاص والفلورة للنوع الفردي باستخدام قارئ لوحة. بعد ذلك ، قم بإعداد مقياس التدفق الخلوي باستخدام مقسمات ومرشحات ثنائية اللون لتغطية نطاقات الفلورسنت التي وجد فيها أن الأنواع المختلفة لها خصائص محددة. لإعداد مرجع من نوع واحد ، استخدم معلمات قياس التدفق الخلوي المحسنة لقياس الخصائص البصرية والفلورية للأنواع الفردية.

بعد ذلك ، قم بإعداد الخلايا التالفة والمتحللة عن طريق أخذ عينة فرعية من الأغشية الحيوية المخففة ، وقم بالطرد المركزي عند 8 ، 000 جم لمدة 10 دقائق ، ثم إعادة تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من 90٪ من الإيثانول. قم بتخزين المعلق طوال الليل عند أربع درجات مئوية ، وكرر العملية مرة أخرى في اليوم التالي. باستخدام نفس إعدادات قياس التدفق الخلوي المحسنة ، قم بقياس الخصائص البصرية والفلورية للخلايا التالفة والمتحللة.

بعد تعيين معلمات مقياس التدفق الخلوي وإنشاء قاعدة البيانات المرجعية ، حان الوقت لبدء جمع العينات لحملة المراقبة. يجب جمع العينات ومعالجتها كما هو موضح في الخطوات السابقة ، باستثناء أن الصوتنة يجب أن تستغرق دقيقة واحدة عند 45 كيلو هرتز. بمجرد أن تصبح جاهزا للتحليل ، خذ عينات من التخزين.

لتجنب انسداد مقياس التدفق الخلوي ، قم بتصفية العينات الفرعية من خلال مرشحات المسام 50 ميكرومتر ، ثم قم بتحميل واحد إلى ملليلترين من العينات الفردية في مقياس التدفق الخلوي وقم بقياس الخصائص البصرية والفلورية لكل جسيم. كرر القياس ثلاث مرات لكل عينة. افتح MATLAB وقم بتشغيل CYT كصندوق أدوات.

بعد ذلك ، قم باستيراد بيانات قياس التدفق الخلوي المنخفض كملف csv إلى برنامج CYT. بعد ذلك ، استخدم تحويل القوس الزائدي لتحويل قنوات الفلورسنت لجميع العينات. أدخل 150 كقيمة العامل المساعد.

تعمل هذه القيمة مع معظم الأغشية الحيوية الضوئية ومقاييس التدفق الخلوي ، ولكن قد يكون التحسين ضروريا. لمراقبة الجودة ، قم برسم ومقارنة الصور البيانية للعينات الفردية والقنوات البصرية والفلورية الفردية للتأكد من عدم وجود قيم متطرفة على المستوى التقني والبيولوجي للنسخ المتماثل. ستظهر القيم المتطرفة في التوزيعات الضوئية الفلورية المتغيرة بشكل كبير بين التكرارات.

بعد ذلك ، قم بدمج التكرارات التقنية في كل تكرار بيولوجي وأخذ عينات فرعية من التكرارات البيولوجية بحيث يتم تمثيل كل منها بنفس العدد من الجسيمات. العدد المثالي للجسيمات التي تم تحليلها بواسطة Barnes-Hut Stochastic Neighbor Embedding هو حوالي 150،000. للمقارنة بين العينات ، حدد فقط تلك العينات التي سيتم مقارنتها وقم بتشغيل تضمين Barnes-Hut Stochastic Neighbor.

بمجرد الانتهاء من الخوارزمية، تظهر قنوات جديدة، تسمى bh-SNE1 وbh-SNE2. تصور البيانات من القنوات الناتجة كمخطط مبعثر لإظهار جميع إحداثيات تضمين الجار العشوائي التي تحتوي على جميع الجسيمات التي تم تحليلها. إذا لم تكن العناقيد قابلة للفصل بصريا ، فمن المحتمل أن يتم استخدام جسيمات كثيرة جدا أو غير كافية في التحليل.

اضبط عدد الجسيمات وكرر التحليل. في خريطة viSNE ، يتم وضع الجسيمات وفقا للتشابه وتجميعها في مجموعات قابلة للفصل بصريا. افحص خصائص الفلورسنت البصرية للعناقيد وقم بتمييز وتسمية تلك المنفصلة جيدا ولها خصائص مختلفة باستخدام أدوات الرسم.

للتحليل الإحصائي اللاحق ، قم بتصدير مجموعات viSNE إلى MATLAB. باستخدام الإجراء المقدم هنا ، تم تحليل العينات المأخوذة من عدة مواقع لتيار محلي في سويسرا. باستخدام خرائط viSNE ، من الممكن التمييز بين الأغشية الحيوية البيئية المختلفة.

هنا تتميز ست عينات مختلفة بكثافات مختلفة في أجزاء مختلفة من خريطة viSNE. تملأ خرائط viSNE الموضحة هنا بجسيمات ذات خصائص بصرية ومضنية مختلفة تعطي أدلة على الأصل الحيوي / اللاأحيائي للجسيمات والمجموعة التصنيفية التي تنتمي إليها الجسيمات الحيوية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يساعد إسقاط قاعدة البيانات المرجعية على خريطة viSNE في تفسير أجزاء الخريطة التي يتم ملؤها بواسطة الأصناف و / أو الجسيمات اللاأحيائية.

يمكنه أيضا تحديد المجموعات السكانية الفرعية المختلفة بين العينات. هنا ، يتم عرض عدد الجسيمات لكل مجموعة سكانية فرعية لكل من التكرارات البيولوجية المختلفة. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ساعتين من جمع العينات إلى التحليل النهائي.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام طرق أخرى مثل فرز الخلايا المنشطة بالفلورة للتحقق من صحة تنبؤات التجميع البصري. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام قياس التدفق الخلوي والتجميع البصري لتحليل الأغشية الحيوية المائية.