ביולוגיה של התא כמותית של הקשורים ניוון מוחיים ב דרוזופילה דרך ניתוח לא משוחדת של חלבונים מתויגות Fluorescently באמצעות ImageJ

פיתחנו שיטה זו כדי לחלץ נתונים כמותיים ממחקרי הדמיה מבוססי פלואורסצנטיות כדי לחלץ תהליכים ביולוגיים מורכבים ודינמיים של תאים במודלים של ניוון עצבי של דרוזופילה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא זרימת העבודה הניתנת להתאמה, אוטומטית למחצה, לניתוח תמונות למזעור הטיית הבחירה, מקסום כוח הדגימה והשגת שחזור ברחבי השדה. ניתן להרחיב גישה זו לניתוח של פונקטה חלבונית אחרת ותאים קשורים לממברנה המעורבים בניוון עצבי שבסופו של דבר ישפרו את ההבנה המכאניסטית שלנו של מחלות ניווניות.

כדי לשמור על הלמינה שלמה במהלך הדיסקציה תחת מיקרוסקופ סטריאו, החלק שני מלקחיים מתחת לרשתית וקרע בעדינות את אמצע העין כדי להסיר את הרשתית. שמירה על המלקחיים במקביל למשטח הלמינה משוך את כל רקמת הרשתית שנותרה המחוברת ללמינה. נתחו שלושה עד חמישה מוחות לכל קבוצה והעבירו את המוחות לצינור מיקרוצנטריפוגה המכיל קיבוע מתאים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר עם נדנוד עדין.

לאחר שלוש שטיפות של 15 דקות עם PBS בתוספת Triton X-100, או PBTx, החלף את השטיפה האחרונה בנוגדנים המעניינים העיקריים המדוללים ב-PBTx בסרום עיזים רגיל של 5% לדגירה של לילה במיקסר aliquot בארבע מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר יש להסיר את הנוגדן העודף בשלוש שטיפות של 15 דקות ב-PBTx ולדגור את המוח בנוגדנים משניים מתאימים המדוללים ב-PBTx עם סרום עיזים 5% רגיל למשך שעה בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה שטפו את המוח שלוש פעמים כפי שהודגם והניחו טיפה של מדיום הרכבה בין שתי חתיכות של סרט שקוף במרכז שקופית מיקרוסקופיה אחת לכל דגימת רקמה.

הנח את המוחות באמצעי ההרכבה למשך דקה עד שתיים. כאשר הרקמות הופכות שקופות, השתמש בפיפטה כדי להסיר בזהירות את אמצעי ההרכבה מכל צד. כדי לדמות את הרקמות המוכתמות, מרחו טיפה של מדיום הרכבה טרי על המוח וכסו בזהירות את הדגימות בזכוכית הכיסוי.

אטמו את קצוות זכוכית הכיסוי במלט גומי וייבשו את השקופיות באוויר למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, צפה בדגימה במיקרוסקופ והתאם את בקרות גלאי התמונה במיקרוסקופ הקרינה כדי ללכוד את יחס האות לרעש הגבוה ביותר בטווח הדינמי הגבוה ביותר של הדגימה. לאחר אופטימיזציה של ההגדרות, הצג דגימה מקבוצה אחרת כדי לאשר שההגדרות יתאימו לאורך הניסוי.

לאחר מכן ניתן לדמות את הדגימה הראשונה תוך הקפדה על שמירת התמונה כסוג קובץ שיכול לשמר מטא נתונים כגון פרמטרי רכישה וכיול מרחבי. לניתוח התמונות, פתח תמונה בפיג'י, בחר View Stack with Hyperstack מתיבת הדו-שיח Bio-formats Import Options והגדר את מצב הצבע לגווני אפור. זהה אזור המבוסס על ערוצי הסמן שיכול לשמש כאזור עניין סטנדרטי על פני דגימות באמצעות פס הגלילה C להצגת הערוצים ופס הגלילה Z כדי לנוע דרך מישורי המוקד.

כדי לפשט את ניתוח התמונה, צור תמונה חדשה הכוללת את הערוצים ומישורי המוקד ובחר Image ו-Duplicate. קבעו את הערוצים והפרוסות הרצויים ושנו את שם הקובץ כך שישקף את הבחירה. בחר ידנית אזור עניין סטנדרטי באמצעות כלי בחירה בהתבסס על קריטריוני הבחירה שנקבעו קודם לכן.

לחץ על ניתוח, כלים, מנהל אזור עניין והוסף כדי להוסיף את אזור העניין למנהל אזור העניין. לאחר מכן לחץ על More ו-Save ותן שם לקובץ כדי לשקף את אזור העניין. לעיבוד מקדים של התמונות, לחצו על 'עבד' ב'מסננים' ובחרו מסנן מתאים.

כאן בחר הגדרות סינון המפחיתות רעש תוך שמירה על קצוות על מנת לסייע בזיהוי המבנים המעניינים במהלך הפילוח. כשהתמונה המעובדת מראש פעילה בפיג'י, לחץ על SCF, Labeling ו-Interactive H_Watershed. מלוח הבקרה התאם את דינמיקת הזרע, סף העוצמה והצפת השיא כדי לייעל את הפילוח.

לאחר אופטימיזציה של תוצאות הפילוח, בחר Export Regions, Mask ו- Export כדי ליצור תמונה בינארית של תוצאות קו פרשת המים. פתח את אזור העניין הסטנדרטי השמור. ממנהל אזור העניין, בחר את מזהה אזור העניין כדי להגביל את חילוץ התכונה לאזור העניין הסטנדרטי בתמונה.

כאשר אזור העניין פעיל במסכת פרשת המים הבינארית, בחר ניתוח, ניתוח חלקיקים והוסף למנהל כדי לחלץ את התכונות להוספת מזהה חלקיקים עבור כל מבנה שתואר במהלך הפילוח למנהל אזור העניין. לאחר מכן שמור את החלקיקים שנוספו תוך הקפדה על ביטול הבחירה במזהים ושכל החלקיקים יישמרו בקובץ zip. כעת פתח את התמונה הגולמית המעובדת מראש וגלול לערוץ המשמש ללכידת המבנים המעניינים.

פתח את החלקיקים שהתקבלו מחילוץ התכונה ובחר הצג הכל במנהל אזור העניין כדי להניח קווי מתאר של כל חלקיק על התמונה. לחץ על נתח והגדר מדידות והגדר את המדידות הניסיוניות המתאימות. לאחר מכן, ממנהל אזור העניין, בחר מדוד והעתק והדבק את התוצאות בתוכנית גיליון אלקטרוני מתאימה לצורך הידור וחישובים נוספים.

כימות מספר אגרגטי הנטינגטין RFP מפולחים למחצה באופן אוטומטי ממישורי מוקד סטנדרטיים דרך האונה האופטית של דרוזופילה חושף ביטוי מפוזר של התרחבות הנטינגטון Q15 הלא פתוגנית בהצטברות אגרגטים חלבונים על ידי התרחבות הנטינגטון Q138 הגורמת למחלה. פרופילי גודל ועוצמה של כל האגרגטים ממישור מוקד סטנדרטי של חמש אונות אופטיות שונות המבטאות את הנטינגטון Q138 ממחישים את החוסן ויכולת השחזור של זרימת עבודה זו. כאשר אגרגטים נחשפים יתר על המידה במהלך רכישת תמונה, כימות הגודל ומספר האגרגטים דומה לאגרגטים שנלכדו בחשיפה אידיאלית.

עם זאת, עוצמת האגרגטים החשופים יתר על המידה הופכת לפונקציה של גודל מכיוון שהפיקסלים הרוויים מציגים את ערך העוצמה המקסימלי. הדמיה של עוצמת mCherry ו-GFP על פני מספר מבנים הקשורים לאוטופגיה או חיוביים Atg8 מגלה הבדלים במדווח כאשר העוצמה הגבוהה של שני הפלואורופורים מצביעה על אוטופאגוזומים. mCherry גבוה ו-GFP נמוך מעידים על היתוך עם ליזוזום מכיוון ש-GFP מרווה בתא חומצי זה.

ולבסוף mCherry נמוך משקף השפלה בתוך הליזוזום. תרשים פיזור שנוצר מעוצמת הפלואורופור הממוצעת של כל חלקיק חיובי mCherry Atg8 מפולח למחצה באופן אוטומטי ממחיש שטף דרך מסלול הליזוזום האוטופגי שניתן להפריד לשלבים נפרדים על ידי ניתוח רבעים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שהפרמטרים המוגדרים על-ידי המשתמש בשלבי ניתוח התמונה תלויים מאוד ביישום.

לכן הקפד לתעד את זרימת העבודה כדי להבטיח עקביות והשוואה בין דגימות.