Genetik bir kanonik olmayan Amino asit antikor-uyuşturucu üretimi için kodlama Conjugates bir hızlı Bioorthogonal tepki

Bu yöntem protein modifikasyonu alanında önemli bir araç sağlar, antikor ilaç conjugates kolay ve verimli nesil sağlayan. Bu tekniğin başlıca avantajları kullanım kolaylığı, antikor üretiminin yüksek verimi, psikodizyon reaksiyonunun hızı ve oluşan bağlantının stabilitesidir. Bu yordamı, metin protokolünde açıklandığı gibi büyüyen HEK süspansiyon hücreleriyle başlayın.

Mililitre başına 2,5 milyon hücrenin yoğunluğuna ulaşıldığında, 1 molar sodyum hidroksitte lizin veya CpK siklopropen türevinin yeni bir çözeltisini hazırlayın. Antibiyotiklerle takviye edilen ifade ortamına 2,5 mililitre CpK ekleyin. Çözeltiyi iyice karıştırın ve bir azı yağı HCl 250 mikrolitre ekleyin, sonra 22 mikron filtre kullanarak çözeltisterilize.

Şimdi 500 x g'de hedef yoğunlukta 125 milyon hücreyi beş dakika santrifüj edin. Santrifüjden sonra, CPK içeren ifade ortamına DNA-transfeksiyon reaktif karışımını ekleyin ve hücreleri yeniden askıya almak için bu ortamı kullanın. CpK eklenmesinden altı ila yedi gün sonra, 3, 000 x g 15 dakika boyunca hücreleri santrifüj tarafından supernatant cpk antikorları taşıyan trastuzumab hasat.

Sonra, supernatant filtre. Şimdi 250 mililitre konik tüpler 5x boncuk yıkama tampon ekleyin ve supernatant ile karıştırın ve önceden ayarlanmış protein A reçine ekleyin. Antikor ve supernatant aşağı çekmek için oda sıcaklığında üç saat boyunca bir rulo üzerinde konik tüp yerleştirin.

Kuluçkadan sonra, protein a reçinesini supernatant ile bir kolona aktarın ve sıvının akmasını bekleyin. Sonra yıkama tampon 25 mililitre ekleyin ve üzerinden akmasına izin verin. Toplama tüpüne bir milimetre lik bir azı dişi fosfat tamponu, 150 milimolar sodyum klorür ekleyin ve antikordan dört mililitre 1 molar sodyum sitrat pH 3 ekleyin.

Asidik çözelti, toplama tüpünde bulunan temel çözelti ile kolondan çıkarken hemen nötralize edilir. Sonra, pbs 10 mililitre ile antikor seyreltin. Santrifüj filtrasyon ile 5-1 mililitre antikor konsantre ve PBS ile tampon üç kez değişimi.

30 dakika boyunca yüksek tuz tampon düşük tuz tampon sıfır ila% 100 degrade ile bir bütil hidrofobik etkileşim sütunu kullanarak FPLC ile örnekleri arındırın. Tüm kesirleri toplamak ve 280 nanometre de elütion izleyin. Santrifüj filtrasyon ile antikor içeren kesirleri yoğunlaştırın ve tamponu PBS ile üç kez değiştirin.

Antikor daha sonra dört santigrat derecede saklanabilir. Monometil auristatin E veya MMAE, son derece zehirlidir. Bu nedenle, MMAE türevlerini kullanırken eldiven ve gözlük kullanın.

Kontrol olarak değiştirilmemiş MMAE kullanıyorsanız, MSO'da stok çözeltisini hazırlarken katı ürünü bir duman kaputunun içinde kullanın. Antikoru tetrazin yatak molekülü ile birleştirmek için, tetrazin MMAE'nin antikor başına 10 molar eşdeğerliğini, 20 mikrolitre asetonitril ve 76 mikrolitre PBS'yi küçük bir konik tüpte seyreltin. CpK taşıyan trastuzumab bir azı dakikası eşdeğeri ekleyin.

Iyice karıştırın ve MMAE bağlı trastuzumab oluşturmak için oda sıcaklığında üç saat boyunca tepki sağlar. MMAE dışındaki moleküller potansiyel olarak daha büyük ve daha sterik olarak engellenmiş olarak bu protokol kullanılarak antikora bağlanabilir. Bir dakika boyunca 1500 x g'de spin sütununa ve santrifüjüzerine reaksiyonun tüm hacmini ekleyin.

Eşlebiği analiz etmek için HPLC HIC sütununa %100 yüksek tuz tamponu ile beş dakika denk verin. Daha sonra mmae'ye bağlı trastuzumabın mililitre çözeltisi başına 15 mikrolitreyi bir şişede 15 mikrolitre 2X yüksek tuz tamponu ile karıştırın. Karışımı HPLC sütununa enjekte edin.

Bir dakika için% 100 yüksek tuz tampon ile dakikada bir mililitre akışı bir otokratik elute. Bunu, düşük tuz tamponundaki yüksek tuz tamponunun yüzde 100'ünden sıfırına kadar 15 dakikalık bir degradeyle takip edin. Elüsyonu 280 nanometreden izleyin.

Kromatogramdaki zirveleri sırasıyla sıfır, bir ve iki konjuge toksiniçeren trastuzumab'a karşılık gelen 7,5, 9,2 ve 11,5 dakika tutma süreleri ile entegre edin. Şimdi, 9,2 dakika, bir ağırlığı olan zirvelerin alanları ekleyerek DAR hesaplayın, ve 10,5 dakika, iki bir ağırlığı vardır, ve üç zirvenin toplam alanına bölün. LC-MS ile konjuge analiz etmek için, ilk, mililitre ADC başına bir miligram 30 mikrolitre deglikozilat ve 37 santigrat derece en az altı saat pngase F 250 birimleri kullanarak azaltıcı olmayan koşullarda değiştirilmemiş antikor.

Serumu eritin ve 22 mikronluk bir filtreden geçirin. Daha sonra 96 kuyuluk bir tablanın dış kuyularını suyla doldurun. Merkezi kuyularda, pbs mililitre trastuzumab tetramethylrhodamine başına mililitre başına 10 mikrolitre ile serum triplicate 90 mikrolitre karışımı mililitre başına 1 miligram nihai konsantrasyonda.

Plakayı 37 santigrat derece ve %4 CO2'de nem le doymuş bir kuvöze yerleştirin. Beş gün boyunca her 24 saatte bir, pipet her iyi iyice karıştırmak ve beş mikrolitre aliquot almak. Flaş sıvı nitrojen ile aliquot dondurma ve 80 santigrat derece de saklamak.

Tüm örnekler toplandıktan sonra, metin protokolünde ayrıntılı olarak belirtildiği gibi, aliquots çözülme ve dolaylı bir ELISA kullanarak analiz. Alternatif olarak, ticari bir ELISA kiti ADC konsantrasyonu ölçmek için kullanılabilir. Tgörünüşe iki gün önce, 96 kuyuluk tabağının dış kuyularını suyla doldurun.

Sonra 5 milimolar EDTA% 05 tripsin ile hücreleri kaldırın. 250 x g'de hücreleri üç dakika santrifüj edin ve yeni ortamda yeniden askıya alın. Sonra 96 kuyu plakasında kuyu başına 100 mikrolitrede 3,000 hücre tohumve kuvöze geri yerleştirin.

Hücreleri tohumlamadan iki gün sonra, tüm numunelerin seri seyreltmelerini tam ortamda %1 DMSO ile üç emetri halinde hazırlayın. Şimdi her kuyuya her numuneden 100 mikrolitre ekleyin ve 5 gün boyunca 37 santigrat derece ve %4 CO2'de kuluçkaya yatırın. Beşinci günde, hücrenin canlılığını ölçün.

Bu amaçla, hücreleri lyse ve yayımlanan ATP ölçmek için ticari bir kit kullanın. %1 DMSO ile tedavi edilen kontrol hücreleri ile ilgili sinyal yüzdesini çizin. ADC'ler serumda beş gün boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırılabilir ve fonksiyonel stabiliteyi kanıtlamak için sitotoksisite için tahpan edilebilir.

Bir siklopropen saplı bir antikor protein A saflaştırma sonra litre başına 20 miligram üzerinde verimleri ile bu prosedür kullanılarak elde edilebilir. Üretilen antikor hızlı ve site özel bir tetrazin taşıyan bir toksin için konjuge olabilir. Bir toksin ile antikor konjugasyonu üzerine, antikor oranları ortalama ilaç 1.9 daha büyüktür, hidrofobik etkileşim kromatografisi ile ölçülen.

ADC'nin kimliği kütle spektrometresi ile doğrulanır. Üretilen dihidropyridizene bağı insan serumunda 5 günden fazla 37 santigrat derecede stabildir. Antikor ilaç konjuge güçlü ve seçici HER2 yüksek düzeyde hücreleri öldürür, HER2 düşük seviyelerde hücreler yerine.

Ayrıca, toksin ve tetrazin bağlayıcı ile modifiye toksin olmadan antikor çok düşük toksisite var. Toksin tek başına seçicilik elde etmek için hedefleme ihtiyacını vurgulayan bir NON-HER2 bağımlı toksisite gösterir. Bu prosedürü takiben, tümörlerin tedavisi için antikor ilaç konjugatlarını hızlı ve verimli bir şekilde hazırlayabiliriz.

Potansiyel olarak, tetrazin ile işlevsel herhangi bir ilaç bir kanser hücresi biyomarker hedefleyen herhangi bir antikor ile bağlantılı olabilir. Bu tekniğin etkileri tedavi veya tanı için tasarlanmış herhangi bir protein konjuge uzanır.