Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
إعادة تشكيل ذبذبات دورة الخلية في ميكرومولسيونس مستخرجات البيض خالية من الخلية النمو
Summary September 27th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
نقدم وسيلة لتوليد في المختبر مكتفية ذاتيا ذبذبات الانقسامية على مستوى خلية واحدة بتغليف البيض مقتطفات من النمو لإيفيس في ميكرومولسيونس الماء في النفط.
Transcript
يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا النظام، مثل آلية التنظيم خلف الشبكة الميتاوتية والخصائص الديناميكية ووظائف ساعة دورة الخلية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها ستولد كمية كبيرة من القطرات مع دورات خلايا متعددة في كل منها، مما يوفر لنا إطارًا عالي الإنتاجية للتلاعب الكمي والتحليل. للبدء، تخلص من دفعات من البيض التي لها حدود غير واضحة بين الأعمدة الحيوانية والنيباتية أو بقع بيضاء غير منتظمة فوق أقطاب الحيوانات.
بعد ذلك ، حدد دفعة مناسبة من البيض من ضفدع أنثى واحدة ، ونقل البيض إلى منقار 600 ملليلتر. صب فائض من 0.2x MMR العازلة، وإضافة بلطف السيستين في 1x استخراج العازلة إلى البيض. بعد هذا، هز القار بقوة باليد لإزالة المعاطف هلام من البيض.
كرر هذا الغسيل ثلاث مرات مع ما مجموعه 800 ملليلتر من العازلة السيستين أو حتى تجمع البيض وتستقر في الجزء السفلي من القارض. بعد إزالة معطف هلام، وغسل البيض أربع مرات في لتر واحد من 0.2x حل MMR. استخدام ماصة زجاجية لالتقاط وتجاهل البيض الذي يتحول الأبيض.
صب العازلة MMR من الكواب، وإضافة 200 ملليلتر من محلول ionophore الكالسيوم في البيض. استخدام ماصة زجاجية لتحريك البيض بلطف حتى يتم تنشيطها، وإزالة محلول ionophore الكالسيوم. ترك البيض في محلول ionophore الكالسيوم لفترة طويلة جدا سوف تبدأ المبرمج.
نحن حرك البيض لمدة 1.5 دقيقة والتحقق من كفاءة التنشيط. إذا لم يتم تنشيطها، استئناف التحريك، والتحقق أكثر من ذلك حتى يتحقق التنشيط 90٪. بعد أن يستقر البيض في الجزء السفلي من القارض ، تحقق من كفاءة التنشيط.
البيض المنشط جيدا لديه ما يقرب من 25٪ من القطب الحيواني و 75٪ من القطب النباتي. بعد ذلك ، اغسل البيض مرتين بحجم إجمالي 50 ملليلتر من مخزن الاستخراج المكمل بمثبطات البروتياز. ثم، نقل بعناية البيض إلى 0.4 ملليلتر المفاجئة كاب microtube.
أجهزة الطرد المركزي microtube لمدة 60 ثانية في 200 غرام ثم في 600 غرام لمدة 30 ثانية لحزمة البيض. ثم، استخدم ماصة باستور الزجاج لإزالة العازلة الزائدة على رأس البيض بعد كل خطوة. بعد ذلك، سحق البيض في 15،000 غرام لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية.
استخدام شفرة حلاقة لقطع الأنابيب لفصل الطبقات الثلاث من البيض سحقت والحفاظ على السيتوبلازم الخام في الطبقة الوسطى. ثم، نقل السيتوبلازم الخام لتنظيف أنابيب فائقة التركيز. تكملة السيتوبلازم مع مثبطات البروتياز وcytochalasin B في 10 ميكروغرام لكل ملليلتر لكل من.
جهاز طرد مركزي السيتوبلازم الخام في 15،000 غرام وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. ثم، استخدم شفرة حلاقة لقطع الأنبوب والحفاظ على السيتوبلازم في الطبقة الوسطى. ضع المستخلصات المعدة حديثًا على الجليد.
أولاً، أضف securin-mCherry mRNA إلى المقتطفات المعدة. بعد ذلك، إضافة 200 ميكرولترات من 2٪ PFPE-PEG الفلوروستورفاكانت لاستخراج خليط مرنا. استخدم خلاط دوامة لتوليد قطرات، وضبط سرعة الدوامة ومدتها حسب الحاجة.
ثم، فحص بصريا قطرات للتأكد من أنها موحدة في الحجم. باستخدام ماصة 200 ميكرولتر، نقل قطرات عائمة على أعلى وحجم متساو من السطح إلى أنبوب PCR. تراجع أنبوب زجاجي في طبقة قطرات، وانتظر حتى قطرات ملء ما يقرب من 75٪ من الأنبوب.
ثم، دفع أنبوب في طبقة السطحي، وملء الأنبوب تماما. بعد ذلك، املأ طبقًا زجاجي القاع بالزيت المعدني. ثم، استخدم ملاقط غرامة لتزج أنبوب قطرة مملوءة في النفط.
استخدم ماصة زجاجية لإزالة أي حطام مرئي أو قطرات مسربة. لتجنب حركة وتسرب قطرات، ينبغي أن تكون مغمورة أنبوب زجاجي مليئة قطرات تحت النفط المعدنية بعناية. يمكننا إما دفع الأنبوب على طرفي مع التوازن أو إضافة بضع قطرات من الزيت المعدني على نهايات الأنبوب في وقت واحد أولا.
بعد ذلك، استخدم مجهر epifluorescence مجهزة مرحلة xy مزودة بمحركات لتصوير القطرات. سجل مقاطع فيديو الفاصل الزمني في الحقل المشرق وقنوات الفلوريسين متعددة كل ست إلى تسع دقائق حتى تفقد القطرات نشاطها. وباستخدام هذا البروتوكول، تم إنتاج التذبذب الميتوتيك في كل من الخلايا البسيطة الخالية من الأسلحة النووية والخلايا المعقدة ذات النوى.
ولدت قطرات خالية من النوى التذبذب الميتو المتعدد يصل إلى 30 دورات غير مختومة على مدى 92 ساعة. كما تم فحص قدرة المذبذب الميتوج على قيادة أحداث مجرى النهر. وقاد المذبذب الميت الذاتي التغيرات في مورفولوجيا المواد النووية التي لوحظت من خلال التغيير المستقل لمراحل دورة الخلية المتميزة.
أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن العقل الوقت عند جعل استخراج، كما أنها حساسة للوقت، ودائما الحفاظ على البيض واستخراج على الجليد. بعد تطورها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا النظام لاستكشاف المبادئ الأساسية لخصائص الساعة المعقدة، مثل قابلية التونة والتونة في Xenopus laevis.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
CH
DE