Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Извлечение внеклеточного Vesicles из цельной ткани
Chapters
Summary February 7th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Здесь мы предоставляем подробный протокол для изоляции малых внеклеточного везикулы (EVs) от всего тканей, в том числе мозга и опухоли образцов. Этот метод предлагает воспроизводимый метод для извлечения EVs из прочной ткани для дополнительного анализа, ниже по течению.
Transcript
Этот протокол обеспечивает строгую и воспроизводимую технику для извлечения и изоляции небольших внеклеточных пузырьков из образцов целых тканей для анализа экс-виво ниже по течению. С одним из самых высоких уровней чистоты в настоящее время достижимы, этот метод облегчает прямой морфологический, иммунофенотипический, и глубокая характеристика интерстициальных пузырьков выделяется в различных образцах тканей, в том числе опухолей. Здесь мы демонстрируем изоляцию тканей EVs от образцов опухоли мозга и легких.
Тем не менее, этот метод может быть применен к исследованиям с использованием различных, доброкачественных или других образцов опухоли, а также. Для начала приготовьте 10 миллилитров буфера диссоциации в среде Hibernate-E на каждые 0,4-1,0 грамма ткани. Добавить целые свежие или замороженные ткани в буфер в 50 миллилитров трубки, и инкубировать в теплой водяной бане при 37 градусов по Цельсию в течение 20 минут.
После этого добавьте ингибиторы протеазы и фосфатазы для окончательной концентрации 1x в буфере диссоциации. Налейте раствор с тканью в свободные подходят падения гомогенизатора. Используйте приблизительно 30 медленных ударов на образец, чтобы мягко разобщить ткани.
Затем перенесите диссоциированную ткань и буферный раствор в 50 миллилитровую коническую трубку. Центрифуга на 500x g и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут, чтобы гранулировать клетки и оставшиеся волокна или сплоченные фрагменты тканей. Перенесите супернатант в чистую 50-миллилитровую коническую трубку и центрифугу при 2000 г и при четырех градусах по Цельсию в течение 10 минут, чтобы гранулировать и выбросить большой клеточный мусор.
Перенесите этот супернатант в чистую коническую трубку 50 миллилитров и центрифугу при 10 000 г и при четырех градусах по Цельсию в течение 40 минут, чтобы гранулировать любые нежелательные большие пузырьки или маленькие апоптотические тела. Декант супернатант через 0,45 микрометровый фильтр в чистую 12 миллилитровую ультрацентрифугированную трубку. Далее, ультрацентрифуг образца на 100,000x g и при четырех градусах по Цельсию в течение двух часов, чтобы гранулировать небольшие EVs.
Декант supernatant и оставить ультрацентрифугации трубки перевернутый в течение пяти до 10 минут, нажав часто, чтобы удалить остатки жидкости по бокам труб. Затем, повторное производство гранул EV в 1,5 миллилитров 0,25 молярной сахарозы буфера. Обложка труб с Parafilm, а затем вихрь EVs в раствор.
Рок ультрацентрифуг трубки в течение 10 до 15 минут при комнатной температуре. А потом вихрь еще раз. Кратко центрифуга труб со скоростью менее 1000x г, чтобы восстановить жидкую подвеску в нижней части трубки.
При необходимости храните подвеску при четырех градусах по Цельсию на ночь. Во-первых, добавить 1,5 миллилитров 60%йодиксанола к 1,5 миллилитров буфера сахарозы tris, который содержит EVs для создания окончательного решения, содержащего 30%iodixanol. Pipette вверх и вниз несколько раз, чтобы смешать раствор тщательно.
Перенесите этот раствор на дно 5,5 миллилитров ультрацентрифугации трубки. Далее, смешать 60%iodixanol запас с ультра чистой водой, чтобы подготовить по крайней мере 1,5 миллилитров как 20%и 10%iodixanol раствор. Используя шприц и 18 калибровочных игл, измерьте 1,3 миллилитров раствора 20%йодиксанола и тщательно наслоьте его поверх нижнего градиента.
Держите скошень иглы в контакте с внутренней частью трубки, чуть выше мениска и добавить раствор падение мудрым, чтобы избежать смешивания слоев на интерфейс плотности. Затем слой 1.2 миллилитров 10%iodixanol раствора на вершине 20%слой, используя ту же технику. Тщательно баланс и загрузить ультрацентрифугации труб в ротор ведра.
Установите скорость ускорения и замедления ротора ведра качели до минимальных ставок, и центрифуги на 268,000x g и при четырех градусах по Цельсию в течение 50 минут. В то время как образец в настоящее время центрифугирован, этикетка 10 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки для каждого образца, который будет соответствовать фракций от одного до 10 градиента плотности. Как только центрифуга будет завершена, аккуратно снимите трубки с ведер ротора и поместите их в стабильный держатель.
Pipette 10 серийных фракций из 490 микролитров из верхней части градиента в соответствующие трубки. Используя рефрактометр, измеряйте рефракционные индексы фракций. Затем перенесите каждую фракцию в чистую 12-миллилитровую ультрацентрифугированную трубку.
Добавить пять миллилитров 1x PBS к каждой трубке и пипетки вверх и вниз медленно смешивать. Добавить еще шесть миллилитров 1x PBS в верхней части трубки, и тщательно перемешать еще раз. Ультрацентрифуг трубки на 100 000x г и при четырех градусах по Цельсию, чтобы повторно гранулировать небольшие пузырьки.
Декант supernatant и нажмите трубки сухой перед лизикулы для анализа белка или reresuspending EVs для морфологического анализа. Чтобы подлизать EVs для анализа белка, добавьте 40 микролитров сильного буфера лиза, содержащего ингибитор протеазы, к гранулам EV. Поместите Parafilm над каждой трубкой, и вихрь энергично.
Далее, рок трубки в течение 20 минут при комнатной температуре и вихрь снова. Кратко центрифуга образца на 1000x г в течение 30 до 60 секунд, чтобы восстановить весь объем образца. Перенесите каждый образец в новую микроцентрифугную трубку мощностью 1,5 миллилитра и храните ее при температуре от 20 до 80 градусов по Цельсию до готовности к дальнейшей обработке.
Чтобы подготовить очищенные лизаты для иммуноблотного анализа, добавьте 5x буфер образца Laemmli к образцам для окончательной концентрации 1x. Отварить образец при 95 градусах по Цельсию в течение пяти-десяти минут. Затем загрузите равный объем фракций от одного до 10 в 10%SDS страницу геля.
Загрузите равную массу гомогената тканей. Выполните электрофорез и западный анализ помарки, чтобы подтвердить белки EV в очищенных лизатах и сравнить относительное изобилие EV в фракциях. В этом исследовании, внеклеточные пузырьки извлекаются и очищаются от целых тканей.
После ультрацентрифугации градиента от 10 до 30%йодиксанола можно увидеть популяцию легких ЭВ, мигрирующих до второй фракции, в то время как популяция плотных ЭВ может быть замечена мигрирующей до пяти фракций, в зависимости от типа ткани. Представительные иммуноблотации градиентных фракций демонстрируют эффективное разделение и очищение мелкой опухоли, полученной ЭВ во фракции 5. Примечательно, что образцы опухоли легких, как представляется, обогащены в плотных EVs по сравнению со светом EVs, которые ранее были собраны из всей ткани мозга.
Репрезентативный анализ слежения за наночастицами и электронная микроскопия тканевых пузырьков в преобладающей везикуле, содержащей фракцию, демонстрируют обогащение и сохранение целых пузырьков. В соответствии с известным размером и структурой малых EVs. Интерстициальные EVs представляют собой перспективные цели для разработки новых диагностических или прогностических анализов биомаркеров.
Этот метод предоставляет исследователям инструменты для извлечения и очистки пузырьков для вниз по течению полезности. После извлечения целых или лизированная ткань EVs, широкая характеристика пузырьков, включая протеомные, геномные и липидомные анализы могут быть выполнены. Кроме того, образцы могут использоваться для более целенаправленных подходов.
Vesicles изолированы непосредственно от образцов тканей может обеспечить дальнейшее понимание механизмов заболевания, в том числе генезиса опухоли, и может обеспечить важные диагностические или прогностические инструменты в будущем.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
