Environment
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
विषाक्त पदार्थों के ट्रांस और बहु-पीढ़ी के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए Caenorhabditis elegans का उपयोग करना
Summary July 29th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
पर्यावरण में और मानव स्वास्थ्य पर उनके दीर्घकालिक परिणामों को पहचानने में लगातार रसायनों के ट्रांस और बहु-पीढ़ी के प्रभाव आवश्यक हैं। हम मुक्त रहने वाले सूत्रकृमि केनोरब्डाइटिस एलेगेन्सका उपयोग करके ट्रांस और बहु-पीढ़ी के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए उपन्यास विस्तृत तरीके प्रदान करते हैं.
Transcript
प्रस्तुत प्रोटोकॉल ट्रांस और प्रोटीन के बहु पीढ़ी प्रभाव है कि पर्यावरण में एक लंबे समय के लिए मौजूद कर सकते है पर अध्ययन की सुविधा होगी । हमने ट्रांस और बहु-पीढ़ीगत प्रभावों का अध्ययन करने में समय और प्रयास बचाने के लिए हर्मेफ्रोडाइट्स के रूप में 99.5 के साथ एक मुक्त रहने वाले सूत्रकृमि को नियोजित किया। इस तकनीक का उपयोग अंत दवाओं के दीर्घकालिक प्रभावों को प्रदर्शित करने के लिए किया जा सकता है क्योंकि वर्तमान प्रोटोकॉल में सूत्रकृमि मनुष्यों के साथ कई रूढ़िवादी तंत्र या रास्ते साझा करता है।
यह विधि दवा संश्लेषण और पर्यावरण प्रबंधन के क्षेत्रों के लिए अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है क्योंकि उन्हें रसायनों के संभावित खतरों की प्रतिक्रिया की आवश्यकता होती है। इस विधि को जलीय विषाक्तता पर अधिक ध्यान देने के साथ डैफनिया मैग्ना पर लागू किया जा सकता है। इसके अलावा लिंग पर प्रभाव का पता लगाने के लिए ड्रोस्फिला मेलानोगेस्टर।
वह या वह विचार है कि पीढ़ियों से अधिक प्रभाव का अध्ययन समय और ऊर्जा लेने वाली है के साथ अटक जाएगा । पहली छाप में भयभीत मत हो। प्रोटोकॉल का पालन करने से आपको सार्थक परिणाम मिलेगा।
ई. कोलाई संस्कृति के लिए, एक फ्लास्क में एलबी माध्यम के ५० मिलीलीटर में बैक्टीरियल निलंबन से पिपेट २०० माइक्रोलीटर । या एनजीएम आगर्स से एक छोटी सी कॉलोनी लेने के लिए एक इनोक्यूलेशन लूप का उपयोग करें और इसे एलबी माध्यम में रखें। सी. एलिगेंस को संस्कृति में, माइक्रोस्कोप के तहत, पहले तैयार स्टैकिंग एनजीएम अगर पर नेमाटोड गिनें।
जब संख्या 2, 000 के करीब पहुंचता है, एक बाँझ टिप का उपयोग करने के लिए NGM आगर के 1/6 कटौती और यह बैक्टीरियल लॉन के साथ नए तैयार NGM agars पर हस्तांतरण । एनजीएम agars उल्टा रखने के बाद संस्कृति के लिए एक 22 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में । लगभग 36 घंटे के बाद, सूत्रकृमि गुरुत्वाकर्षण हो जाते हैं।
बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूबों में प्रत्येक एनजीएम एगर पर ग्रेविड नेमाटोड और नए उत्पादित अंडों को फ्लश करने के लिए बाँझ पानी के दो मिलीलीटर का उपयोग करें। ट्यूबों को नेमाटोड को व्यवस्थित करने के लिए 30 मिनट के लिए एक रैक पर रखें, और फिर 85% सुपरनेटेंट को पिपटिंग करके त्याग दें। यह न्याय करना बहुत महत्वपूर्ण है कि क्या निमाटोड सिंक्रोनाइजेशन के लिए पर्याप्त ग्रेविड हैं।
अन्यथा, उम्र-सिंक्रोनाइजेशन ऑपरेशन व्यर्थ होगा। सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान के सात संस्करणों के साथ छर्रों मिश्रण और लार्वा और वयस्क सूत्रकृमि lyse करने के लिए पांच से आठ बार के लिए हर दो मिनट में अपकेंद्रित्र ट्यूब हिला। 20 डिग्री सेल्सियस पर तीन मिनट के लिए 700 बार जी पर ट्यूबों को अपकेंद्रित्र करें और फिर पिपटिंग करके सुपरनेटेंट को त्याग दें।
उम्र के सिंक्रोनाइज्ड अंडों को धोने के लिए बाँझ पानी के पांच खंडों में छर्रों को फिर से निलंबित करें। 20 डिग्री सेल्सियस पर तीन मिनट के लिए ७०० बार जी पर सेंट्रलाइज । बाँझ पानी से धोएं, दो बार।
इसके बाद, उम्र-सिंक्रोनाइज्ड अंडों को फिर से निलंबित करने के लिए ट्यूबों में बाँझ पानी की एक मात्रा जोड़ें। बैक्टीरियल लॉन के साथ प्रत्येक नए एनजीएम एगर पर पचास माइक्रो लीटर पाइपिंग करके अंडे के निलंबन वितरित करें। एनजीएम एगर्स को 30 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में ऊपर की ओर रखें, जिससे पानी वाष्पित हो जाए या बैक्टीरियल लॉन द्वारा अवशोषित हो सके ।
फिर, एनजीएम agars पर बारी, उल्टा, बाद की संस्कृति के लिए, और अंडे के समय के रूप में समय चिह्नित । अंडे के समय के 36 घंटे बाद, निमाटोड एल 3 लार्वा चरण तक पहुंचते हैं। अपकेंद्रित्र ट्यूबों में प्रत्येक एनजीएम एगर से निमाटोड फ्लश करने के लिए बाँझ पानी के दो मिलीलीटर का उपयोग करें।
30 मिनट तक बसने के बाद, 85% सुपरनेटेंट को कश्मीर मीडियम से बदलें ताकि दो घंटे तक हिम्मत में भोजन को पचाएं। इसके बाद सुपरनेटेंट को त्याग दें। बाद के प्रयोगों के लिए 100 माइक्रोलीटर के बारे में 200 सूत्रकृमि के लिए सूत्रकृमि निलंबन को समायोजित करने के लिए कश्मीर माध्यम का उपयोग करें।
बढ़त के प्रभाव से बचने के लिए, 96-अच्छी तरह से बाँझ माइक्रोप्लेट के मध्य क्षेत्र में, तैयार नियंत्रण या रासायनिक समाधानों के 100 माइक्रोलीटर को 10 कुओं में जोड़ें, जैसा कि छह समूहों में प्रतिकृति है। 60 कुओं में से प्रत्येक में तैयार सूत्रकृमि कश्मीर माध्यम के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। समय को टी0 के रूप में चिह्नित करें। 24 से 96 घंटे के लिए एक्सपोजर प्रदर्शन करें।
एक्सपोजर के बाद, प्रत्येक समूह में पांच कुओं से सूत्रकृमि एकत्र करने के लिए एक पिपेट का उपयोग छह 1.5 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब में करें। नेमाटोड को 30 मिनट के लिए व्यवस्थित करें और फिर सुपरनेट को त्यागने के लिए पिपेट करें। नीचे नेमाटोड को एक मिलीलीटर निष्फल पानी से धोएं।
नेमाटोड को 30 मिनट के लिए व्यवस्थित करें। सुपरनेटेंट को त्यागें, और एफ0 के रूप में चिह्नित उजागर मूल पीढ़ी के संकेतक माप के लिए नीचे सूत्रकृमि का उपयोग करें। प्रत्येक समूह में शेष पांच कुओं से सूत्रकृमि लीजिए। पहले की तरह नेमाटोड को व्यवस्थित करें और धोएं।
इसके बाद, प्रत्येक ट्यूब में नेमाटोड को फिर से निलंबित करने के लिए बाँझ पानी के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें, और बैक्टीरियल लॉन के साथ तीन नए तैयार एनजीएम एगर पर समान रूप से निमाटोड निलंबन स्थानांतरित करें। गुरुत्वाकर्षण बनने के लिए 36 घंटे के लिए नेमाटोड को इनक्यूबेट करें, और पहले की तरह उम्र-सिंक्रोनाइजेशन करें। 36 घंटे के लिए बैक्टीरियल लॉन के साथ एनजीएम अगर पर सिंक्रोनाइज्ड अंडे इनक्यूबेटिंग के बाद, नेमाटोड को छह अपकेंद्रित्र ट्यूबों में फ्लश करें।
निष्फल पानी के एक मिलीलीटर के साथ बसने और धोने के बाद, टी 1 के रूप में चिह्नित वंश पीढ़ी के संकेतक माप के लिए नीचे नेमाटोड का उपयोग करें। नियंत्रण या रासायनिक समाधान के एक मिलीलीटर के साथ गर्म एनजीएम agars के 99 मिलीलीटर मिलाएं। पांडुलिपि के अनुसार बैक्टीरिया निलंबन के साथ agars तैयार करने के बाद, जैव सुरक्षा कैबिनेट में, पेट्री व्यंजन के ऊपरी lids अलग सेट और 15 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के लिए जीवाणु लॉन का पर्दाफाश । यूवी-इलाज एगर्स पर उम्र-सिंक्रोनाइज्ड अंडे को पिपेट करें।
दिन शून्य के रूप में मूल पीढ़ी, F0 के लिए जोखिम की शुरुआत चिह्नित करें। तीन दिन तक आगरों को 20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। फिर, एफ0 में प्रभाव को मापने के लिए परिपक्व सूत्रकृमि का उपयोग करें। इसके अलावा, तीन दिन, एक मानव निर्मित फाइबर तार के साथ फिट एक गिलास रॉड का उपयोग करने के लिए एक अंगूठी में तुला F0 परिपक्व सूत्रकृमि लेने के लिए, और नई यूवी की सतह पर स्लाइड-NGM agars इलाज ।
चार दिन, बाहर उठाओ और NGM agars से परिपक्व F0 सूत्रकृमि त्यागें । छह दिन पर, F1 परिपक्व सूत्रकृमि का उपयोग करें जिन्होंने सूचकांकों के मापन के लिए तीन दिनों के लिए एक्सपोजर का अनुभव किया है। इस प्रोटोकॉल में, शरीर को झुकाने वाली आवृत्ति पर कैडमियम, कॉपर, सीसा और जस्ता के ट्रांस-पीढ़ीगत प्रभावों से पता चला कि जन्म के पूर्व जोखिम के बाद नेमाटोड माता-पिता, एफ0 में संकोच उनकी संतान, T1 की तुलना में कम थे। नेमाटोड उम्र और प्रजनन पर सल्फामेथॉक्साजोल के बहु-पीढ़ीगत अवशिष्ट प्रभावों से पता चला कि प्रजनन रोगाणु-रेखा जोखिम में काफी प्रभावित हुआ था, और टी 3 से टी 6 पीढ़ियों तक गैर-उजागर पीढ़ियों में विषाक्तता कायम थी।
नेमाटोड बायोकेमिकल और जेनेटिक इंडिविजुअल्स पर लिंडेन के मल्टी-जेनरेशनल एक्सपोजर और मल्टी-जेनरेशनल अवशिष्ट प्रभावों ने इंसुलिन सिग्नल रेगुलेशन में गड़बड़ी के साथ मोटापोजेनिक प्रभाव दिखाया । इसके अलावा, एसजीके-1 और एकेटी-1 सिग्नलिंग के बीच हुए बदलावों से संकेत मिलता है कि विभिन्न एक्सपोजर पीढ़ियों से निमाटोड ने सहिष्णुता और परिहार के लिए विभिन्न प्रतिक्रिया रणनीतियां दिखाईं । प्रत्येक ऑपरेशन से पहले सूत्रकृमि के रहने की स्थिति की जांच करें, और तदनुसार निम्नलिखित चरणों को संशोधित करें।
अन्य प्रभाव, उदाहरण के लिए, रसायनों के मोटापे के प्रभाव को पीढ़ियों से मोटापे की बढ़ती व्यापकता का उत्तर देने के लिए शामिल किया जा सकता है। विधि के आधार पर, आगे तंत्र का पता लगाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, पीढ़ियों के बीच वंशानुगत एपिजेनेटिक संकेत।
क्लोरीन समाधान में मजबूत ऑक्सीडेटिव क्षमता होती है, और त्वचा के सीधे संपर्क से बचें।
Related Videos
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
CH
DE