Un modelo de ratón del trasplante de bazo heterotópico vascularizado para estudiar biología de células del bazo y inmunidad al trasplante

El modelo de ratón de trasplante de bazo ofrece una gran oportunidad para descubrir el papel de las células del bazo en la regulación de las respuestas inmunitarias locales y sistémicas en la enfermedad inflamatoria. La principal ventaja de este protocolo es que mediante el uso de ratones congénicos, el trasplante de bazo permite comprobar el destino, la longevidad y la función de las células del bazo. Antes de comenzar el procedimiento, coloque una cortina desechable estéril sobre la plataforma quirúrgica y confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo del producto en el ratón donante anestesiado.

Afeitar el cabello de toda la zona abdominal y colocar el ratón en una plataforma quirúrgica estéril bajo un microscopio operativo a un aumento de 6 a 10X. Esterilice la piel expuesta con una almohadilla de preparación de alcohol y asegure las extremidades con cinta quirúrgica. Introduzca el abdomen a través de una incisión vertical de la piel de tres a cuatro centímetros desde el pubis hasta el proceso de xyfoide.

Cauterizar los vasos de la piel y extender la incisión al abdomen lateral en ambos lados para lograr una mejor exposición. Usando un hisopo de algodón estéril, mueva los intestinos hacia el flanco derecho del abdomen para exponer el bazo y use un cautelemiento estéril a baja temperatura para cauterizar la vena gástrica corta unida al bazo. Coloque un trozo de gasa estéril empapada con solución salina de 37 grados Celsius sobre el bazo para mantenerla húmeda y separada y movilizar la vena porta del tejido pancreático.

Ligar las ramas de la vena porta como se demuestra. Coloque una sutura alrededor de la vena distal porta de la vena esplénica y gire el bazo hacia el lado derecho para exponer la aorta y la arteria esplénica en el tronco celíaco. Diseccionar y movilizar las arterias esplénicas celíacos aórticas y colocar una sutura alrededor de la aorta proximal a la arteria celíaca.

Inyectar 100 unidades internacionales de heparina en la vena cava inferior o IVC para heparinizar todo el cuerpo. Después de tres minutos, ligar las arterias hepáticas y gástricas de la aorta proximal a la arteria celíaca. Transecta la vena porta y perfunde todo el cuerpo con 10 mililitros de solución salina heparinizada de cuatro grados Celsius desde la aorta abdominal distal hasta el tronco celíaco.

Recoger el injerto de bazo y bloquear con el segmento celíaco aórtico asociado en la vena porta junto con el segmento de la vena esplénica y una pequeña porción de tejido pancreático. A continuación, conservar el injerto en cinco mililitros de cuatro grados Celsius salina. Ingrese el abdomen receptor a través de la incisión de la línea media después de que el área quirúrgica se prepara como para el donante y retire el bazo nativo receptor mediante la ligación de la vena esplénica y la arteria.

Cubra los tejidos intestinales con una gasa empapada de 37 grados Celsius y mueva cuidadosamente el intestino hacia el lado izquierdo. Diseccionar y ligar las ramas lumbares de la aorta infrarroja en el CIV y sujetar la aorta infrarroja en el CIV con dos abrazaderas microvasculares de cuatro mililitros. Colocar una sutura de nylon 11-0 a través de la aorta infrarroja y retraer el recipiente para permitir la creación de una aortotomía elíptica con microscisores.

Utilice una aguja de calibre 30 para perforar el CIV y crear una venotomía elíptica y extender la abertura hasta la longitud de la vena porta del donante. Enjuague la aorta y el CIV con 500 microlitros de solución salina heparinizada para eliminar la sangre intraluminal o los coágulos de sangre de los vasos y colocar el injerto de bazo del donante en el flanco derecho del abdomen receptor. Identifique cuidadosamente el manguito aórtico del donante y la vena porta.

Después de confirmar que los vasos no están torcidos, cubra el injerto de bazo con gasa empapada de solución salina de cuatro grados Celsius. Usando dos suturas de 11-0 permanecer, conecte el manguito aórtico del donante al ápice proximal y distal de la aortotomía receptora y haga una anastomosis con dos o tres mordeduras de suturas continuas de nylon 11-0 entre el manguito aórtico del donante y la pared anterior de la aotomía receptora. Gire el injerto de bazo hacia el lado izquierdo del receptor y haga la anastomosis entre el manguito aórtico del donante y la pared posterior de la aortotomía receptora.

Realizar la anastomosis venosa entre la vena porta del donante y el CIV receptor con de cuatro a cinco bocados de suturas continuas en cada lado. Suture la pared posterior dentro del lumen del vaso primero y luego cierre la pared anterior usando la misma sutura. Completar la anastomosis con un nudo colocado en la esquina inferior fuera de la CIV.

Ahora suelte las abrazaderas del recipiente y use un hisopo de algodón estéril para taponar el sangrado hasta que se recupere el color del bazo. Cierre el abdomen con una sutura Vicryl sintética absorbible de 5-0 en un patrón continuo y cierre la capa de la piel con una sutura de nylon 5-0 en un patrón interrumpido. A continuación, inyecte 250 microlitros de solución salina caliente por vía subcutánea en cuatro lugares separados y caliente el ratón en una incubadora controlada por temperatura de 30 grados Celsius durante las primeras horas después de la operación con monitoreo hasta que el animal haya recuperado la conciencia suficiente para su transferencia a la jaula doméstica.

La hematoxilina y la eosina de los isinjertos del bazo días uno y siete después del trasplante revelan que la arquitectura de los isinjertos del bazo permanece intacta durante la primera semana postoperatoria. El análisis citométrico de flujo para investigar la migración de células del bazo de los donantes después del trasplante demuestra que aproximadamente el 50% de las células del bazo son donantes derivados en un día después del trasplante y aproximadamente el 46% son madres del receptor. Siete días después del trasplante, los leucocitos derivados del donante representan aproximadamente el 32% del total de células del bazo, mientras que las células derivadas del receptor aumentaron hasta aproximadamente el 53%Los leucocitos esplénicos de donantes también migraron a los ganglios linfáticos, la sangre y la médula ósea tan pronto como el primer día y se mantienen al menos hasta el séptimo día generando una quimera única para la investigación del tráfico de esplenocitos.

El uso de ratones con imitación modificados genéticamente como donantes de bazo permitirá la investigación de las funciones de los mediadores derivados de células del bazo o de las vías clave de señalización en los procesos de la enfermedad. Este modelo podría ser una herramienta poderosa para explorar los mecanismos de las poblaciones de células del bazo en respuesta a patógenos, lesiones, inflamación o rechazo de trasplantes.