Voorbereiding van de muis netvlies Cryo-profielen voor Immunohistochemistry

Muis retinale dissectie is een echt delicaat proces als gevolg van de grootte en vorm van de ogen en de kwetsbaarheid van het netvlies sectie. Noodzakelijk om te oefenen, met een gedetailleerd protocol dat efficiënte methode en tips bieden is de sleutel tot hoge kwaliteit retinale dissectie en sectie. We geven tips en advies om onderzoekers te helpen veelvoorkomende valkuilen te vermijden en een aantal hoogwaardige netvliessecties te verkrijgen die geschikt zijn voor immunohistochemie.

Markeer het tijdelijke deel van het oog van een geëuthanaseerde muis met behulp van een staart cauterizer door het aanraken van het hoornvlies zeer licht en voor niet meer dan een fractie van een seconde om iets te branden het hoornvlies en vermijd het maken van een gat. Onmiddellijk daarna gebruikt gebogen Dumont 545 tangen om muisogen te geven. Plaats de ogen in een 1,5 milliliter cryotube met een milliliter van 4%PFA en PBS en incubeer gedurende 15 minuten op ijs.

Breng vervolgens de vaste ogen met behulp van de gebogen Dumont 545 tangen over naar een gemodificeerde 35 millimeter dissectieschotel gevuld met PBS en plaats onder ontledenmicroscoop. Gebruik een micromes om een kleine incisie te maken bij de brandwond loodrecht op en net boven de limbus grens van het hoornvlies. Steek gebogen schaar in de incisie en voer een omtreksnede van het hoornvlies na de limbus.

Dan, met behulp van dunne Dumont 5 tangen, verwijder het hoornvlies, extract van de lens, en til het subtiel uit de buurt van het achterste gedeelte van het oog. Het glasvocht lichaam zal komen met de lens en het netvlies zal zichtbaar zijn als een wit oppervlak dat de binnenkant van de achterste oogbeker. Was de geïsoleerde oogcups twee keer in één milliliter PBS gedurende 10 minuten op kamertemperatuur.

Om de oogbekers te cryo-beschermen, equilibrate ze in 15% sacharose en PBS 's nachts op vier graden Celsius totdat ze zinken. Breng vervolgens de oogcups over naar 30% sacharose en PBS gedurende twee tot drie uur totdat ze zinken. Plaats de oogcups in OCT in 10 bij 10 millimeter cryo-mallen voor inbedding.

Onder een ontledende microscoop, oriënteren het oog in de cryo-mal langs de rug ventrale as door het draaien van het oog tot de brandwond is op de top. De oogzenuw is een van de linker en de uitgesneden deel van de mal gezichten aan de rechterkant. Om het netvliesweefsel te bevriezen, dompelt u de cryo-mal gedurende ten minste vijf minuten onder in een metalen beker met isopentane en plaatst u het bekerglas in vloeibare stikstof tot een derde van de hoogte van het bekerglas.

Verwijder het bevroren blok, wikkel het in aluminiumfolie en bewaar op min 80 graden Celsius. Gebruik een pen of Sharpie om het bevroren blok te markeren om de afdrukstand op te nemen. Na het aanpassen van de cryostat temperatuur tussen min 20 en min 25 graden Celsius, plaats de mallen met de ingebedde oogcups binnen en laat ze in evenwicht zijn met de cryostat temperatuur gedurende een uur.

Installeer het blok in de cryostat met de rug ventrale oriëntatie en beginnen met het snijden van 10 micrometer dikke seriële secties. Plaats voorzichtig de netvliessecties op geannoteerde en genummerde microscoopdia's en bewaar vervolgens in diadozen bij min 20 graden Celsius of min 80 graden Celsius tot ze klaar zijn voor immunostaining. Immunohistochemie met antilichamen tegen rhodopsine, een fotoreceptormarkering, glutaminezuur decarboxylase 65, en amacrine celmarker, glutamine synthetase en Muller-celmarker en calbindin, een horizontale celmarker, werd uitgevoerd op netvliessecties.

De resultaten geven aan dat dit protocol levert hoge kwaliteit en goed bewaard netvlies secties in tegenstelling tot in slechte kwaliteit retinale secties verkregen uit een ander protocol. Rhodopsine rijke binnenste en buitenste segmenten blijven verticaal en intact met weinig tot geen scheiding van bovenalig het netvlies gepigmenteerde epitheel. Interneuronen, zoals Gad65 positieve amacrine cellen, blijven goed gestratificeerd binnen de binnenste nucleaire laag en binnen plexiforme laag.

Ook Muller cellen blijven goed bewaard met soma goed uitgelijnd in cytoplasma processen die zich uitstrekken van de ganglion cellaag naar de buitenste nucleaire laag. Bovendien zijn goed gedefinieerde horizontale cellen detecteerbaar bij de binnenste kernlaag en buitenste plexiforme laagrand. Het is belangrijk om de topper regio van de ogen te markeren en de oriëntatie te behouden tijdens het inbedden.

Bereid paraformaldehyde altijd onder de motorkap met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen.