Biochemistry
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Kinase inhibitor screening i selv-monterte Human protein Microarrays
Chapters
Summary October 23rd, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
En detaljert protokoll for generering av selv-monterte humant protein Microarrays for screening av kinase hemmere presenteres.
Transcript
NAPPA er en kraftig proteinmikroarrayplattform som kan brukes til studiet av proteinaktivitet og funksjon på en objektiv høy gjennomstrømning. Proteinene som vises på NAPPA produseres i et menneskelig basert uttrykkssystem ved hjelp av menneskelige avledede ribosomer og chaperones for å forbedre sannsynligheten for naturlig folding og aktivitet. Bruken av NAPPA-arrayer for screening av kinasehemmere gir en ny plattform for test av nye legemidler og klinisk relevante kinasemutasjoner.
Proteinmikroarrayer generert av NAPPA-metodikk kan brukes til mange forskjellige applikasjoner, inkludert biomarkøroppdagelse, protein-proteininteraksjoner, substratidentifikasjon og legemiddelscreening. Utfør kvalitetskontrolltrinn underveis. Test kvaliteten på DNA-preparatet, DNA-mikroarrayet og proteinmikroarrayet.
Hvis kvaliteten i noen trinn ikke er bra, bare begynn på nytt. Å demonstrere prosedyren vil være Lisa Miller, en tekniker i laboratoriet mitt. For å forberede bakteriell vekst for i huset høy gjennomstrømning mini-prep, først inokulere bakteriene i naverplaten i et 96-brønnformat, og la den vokse i 16 timer.
Neste dag, fyll hver brønn av den dype brønnplaten med 1,5 milliliter med fantastisk kjøttkraftmedium, supplert med antistoff ampicillin. Antistoffet avhenger av valgmarkøren på plasmid. Deretter steriliserer du en 96-pinners enhet med 80% etanol og flamme.
Bruk den sterile 96-pinners enheten til å plukke kolonier fra natten inkubert agar plate og senke ned i brønnene på den dype brønnplaten for å inokulere kulturen. Dekk blokken med en gassgjennomtrengelig forsegling og inkuber på en shaker i 22 til 24 timer ved 37 grader Celsius, og 300 til 800 rpm. Etter det, pellet kulturer og gjenbruke kulturer i henhold til manuskriptet.
Lyse bakterier ved å legge til 200 mikroliter løsning to i hver brønn, forsegle platen med en aluminiumsforsegling, og invertere fem ganger. Inkuber cellene i nøyaktig fem minutter. For å nøytralisere løsningen, tilsett 200 mikroliter løsning tre, forsegle platen med en aluminiumsforsegling og invertere fem ganger.
Deretter spinner du platen ved 3800 G, fire grader Celsius, i 30 minutter for å fjerne lysate supernatant. For å forberede anion utveksling harpiks plater, først, bland anion utveksling slurry, og hell slurry i et glass trau. Stable filterplater på toppen av en dyp brønnplate for å fungere som et avfallsinnsamlingsfartøy.
Deretter, ved hjelp av wide board P1000 tips, bland slurry, og overføre 450 mikroliter av slam til hver brønn av filterplatene. Sentrifuge og kast gjennomstrømningen. Nå overfører du lysate supernatantene til bunken med harpiksplate og dyp brønnblokk.
Spinn de stablede platene i fem minutter ved 30 ganger G med den tregeste opptrappingshastigheten og kast gjennomstrømningen. For å vaske kolonnen, legg til 400 mikroliter løsning N3 vaskebuffer til hver brønn. Overfør harpiksplaten til vakuummanifolden for å fjerne vaskebufferen.
Gjenta vasketrinnet tre ganger, og fjern deretter eventuell gjenværende skivebuffer med en kort fem minutters spinn på 30 ganger G.To elute DNA, plasser harpiksplaten på en ren 800 mikroliteroppsamlingsplate. Tilsett 300 mikroliter oppløsning N5 til hver brønn og la den sitte ved romtemperatur i ti minutter. Deretter spinner du de stablede platene i fem minutter ved 20 ganger G med langsom opptrappingshastighet til 233 ganger G i ett minutt.
Oppbevar plater ved negative 20 grader Celsius før bruk. Plasser først lysbildene på et stativ og senk lysbildene i glassreservoaret som inneholder beleggoppløsningen av 2% aminosilanereagens i aceton. Rock lysbildene i 15 minutter.
Skyll deretter lysbildene i aceton etterfulgt av en endelig skylling i vann. Tørk deretter lysbildene med trykkluft. Blåser på dem fra alle vinkler i ca tre minutter til alle vanndråper er fjernet.
Oppbevar de belagte skliene ved romtemperatur på et metallstativ inne i en tett forseglet boks. Nå, fortsett å utløse DNA som beskrevet i manuskriptet. Deretter, resuspend DNA pellet i 20 mikroliter ultrapure vann og riste på 1000 rpm i to timer.
For å forberede arrayprøven, legg til 10 mikroliter nylaget utskriftsblanding som inneholder antistoffet, krysskoblingen og polylysinen til hver DNA-prøve. Tetningsplater med aluminiumsfolie og rist ved romtemperatur i 90 minutter ved 1000 o/min. Oppbevar platene over natten ved fire grader Celsius.
På utskriftsdagen, kort virvel og spinn platene. Overfør 28 mikroliter av hver prøve til en 384 brønnplate. Plasser aminosilanebelagte lysbilder og 384-brønnplaten, på arrayerdekket, og start mikroarrayutskriftsprogrammet.
Når utskriften er ferdig, merker du mikroarrayene. Mikroarrayene kan lagres i flere måneder til videre bruk. For å måle nivåene av DNA, plasser lysbildene i en pipetteboks og blokker dem med 50 milliliter blokkerer buffer.
Inkuber lysbildene på en gyngeshaker ved romtemperatur i en time. Deretter kaster du løsningen og legger til 20 milliliter blokkerende buffer og 33 mikroliter fluorescerende DNA intercalating fargestoff. Inkuber i 15 minutter med agitasjon.
Etter at inkubasjonen er over, skyll raskt lysbildene med ultra rent vann og tørk med trykkluft. Mikroarrayene er klare til å skannes. For å uttrykke mikroarrayene, blokker lysbildene som tidligere vist og skyll dem deretter med ultra rent vann, og tørk med filtrert trykkluft.
Fest en tetningspakning til hvert lysbilde. Tilsett 130 milliliter in vitro transkripsjon og oversettelsesblanding på lysbildene, og masser forsiktig tetningspakningene slik at in vitro-transkripsjonen og oversettelsesblandingen sprer seg ut og dekker hele området av matrisen uten bobler. Påfør de små runde porttetningene på begge portene.
Inkuber i 90 minutter ved 30 grader Celsius for proteinuttrykk, etterfulgt av 30 minutter ved 15 grader Celsius for immobilisering av spørringsproteinet. Deretter fjerner du pakningen, vask lysbildene tre ganger i fem minutter hver i 15 milliliter TBST med melk, og blokkerer i samme løsning i en time. For påvisning av proteinene på matrisen, fjern TBST med melk, plasser lysbildene på en gitterplate, og bruk 600 mikroliter primært antistoff, musanti-flagg, fortynnet en til to hundre og 1x TBST supplert med 5%melk.
Inkuber i en time ved romtemperatur. Vask lysbildene med 50 milliliter 1x TBST og 5% melk på gyngeshakeren tre ganger i fem minutter hver. Gjenta prosedyren for det sekundære antistoffet.
Etter at en times inkubasjon er over, vask lysbildene med 1x TBST på gyngeshakeren tre ganger i fem minutter hver. Skyll deretter glisene raskt med ultra rent vann, og tørk med trykkluft. Lysbildene er klare til å skannes.
For å utføre fosfatase- og DNase-behandlingen, vask og blokker de uttrykte lysbildene med TBST supplert med 3% BSA som beskrevet i manuskriptet. Deretter plasserer du lysbildene på en gitterplate og påfør 200 mikroliter fosfatase DNase-løsning. Plasser en mikroarray deksel slip på toppen for å unngå fordampning.
Inkuber ved 30 grader Celsius i en time og 30 minutter i ovnen. Vask deretter lysbilder med 1x TBST og 0,2 molarnatriumklorid på gyngeshakeren tre ganger i fem minutter hver. For å utføre medikamentbehandling og kinasereaksjon, plasser lysbildene på rutenettplaten og bruk 200 mikroliter med narkotikakinaseløsning.
Plasser en dekselslipp på toppen for å unngå fordampning. Inkuber i en time ved 30 grader Celsius i ovnen. Nøkkelen til reproduserbare data er konsistent inkubasjonstid på tvers av lysbilder.
Dette spesielt viktig under kinasereaksjonen. Tiden det tar å behandle hvert lysbilde, bør gjøres rede for. Deretter vasker du lysbilder med 1x TBST og 0,2 molarnatriumklorid på gyngeshakeren tre ganger i fem minutter hver.
Gjenta proteindeteksjon ved hjelp av som primært antistofffosfosforinantistoff fortynnet ett til 100 i TBST, supplert med 3 % storfe serumalbumin. Bruk 1x TBST og 3 % storfe serumalbumin til vasking etter inkubasjonen med primært antistoff, og TBST for vask etter inkubasjoner med sekundært antistoff. Vask og tørk som tidligere.
For bildeoppkjøp, last mikroarrayene inn i lysbildeholdermagasinet. Legg bladet inn i mikroarrayskanneren. Skann alle mikroarrayer med de optimaliserte innstillingene, og husk å slå av automatisk forsterkning når du sammenligner bilder på tvers av eksperimenter.
Overfør bildene til en kvantifiseringsprogramvare, juster rutenettet etter flekkene, og kvantifisere signalintensiteten til hver funksjon på mikroarrayet. Fortsett med statistisk analyse. I denne studien viste mikroarray de fleste flekker som inneholder komplementært DNA vellykket vist påviselige nivåer av protein.
NAPPA kinase mikroarrays viste god reproduserbarhet blant lysbilder, med korrelasjonen av nivåene av protein display blant distinkte utskriftspartier høyere enn 0,88. Representative resultater av kinaseaktivitet i NAPPA kinasearrayer viste høye nivåer av proteinfosforylering etter uttrykk. Sammenligningen mellom mikroarrayer der fosforyleringsnivåene ble målt rett etter fosfatasebehandling, og etter 60 minutter med autofosforyleringsreaksjon, antyder tilstedeværelsen av aktive proteinkinaser på matrisen.
På NAPPA kinase arrays viste imatinib en signifikant reduksjon i ABL1- og BCR-ABL1-aktivitet, mens andre kinaser forble for det meste upåvirket. Kinaseaktiviteten normalisert mot det defosforolerte arrayet og representert som en prosentandel av den positive kontrollen mikroarray viste selektiv hemming av imatinib mot ABL1 og BCR-ABL1. Typiske resultater oppnådd for ibrutinibscreeningen viste at kinaseaktiviteten til ABL1 ikke-relevant kinase ikke påvirkes.
BTK kanonisk mål, og ERBB4 potensielle nye mål, Viste redusert aktivitet i nærvær av ibrutinib. Dataene tyder på at ERBB4 kan hemmes av ibrutinib på en dosespesifikk måte. Suksessen til proteinmikroarrayscreeninger er svært avhengig av kvaliteten på mikroarrayet selv.
Flere positive og negative kontrollfunksjoner bør brukes til å tillate riktig dataanalyse. NAPPA kinase analyse er en screening plattform, og som sådan, data innhentet bør valideres i oppfølginganalyser, som kan omfatte in vitro kinase analyser, eller cellebaserte analyser. Siden vår protokoll starter med cDNA, kan enhver kinasemutasjon eller variasjon enkelt innlemmes i mikroarrayet og studeres i høy gjennomstrømning.
Under fremstillingen av anionutvekslingen harpiksslam og plater anbefales det bruk av masker for å forhindre mulig innånding av harpikspartiklene.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
