Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
自由に動く動物の神経活動を記録するマルチファイバー光メトリー
Chapters
Summary October 20th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
このプロトコルでは、マルチファイバーフォトメトリー記録の実装と実行方法、カルシウムに依存しないアーティファクトの修正方法、およびデュアルカラーフォトメトリイメージングに関する重要な考慮事項について詳しく説明します。
Transcript
繊維フォトメトリーCSOMイメージングは、遺伝子組み換えカスタム指標と光ファイバーを組み合わせて、自由に動く動物の神経活動を監視します。これは、特定のニューロングループがアクションや刺激を指示または応答する際にどのように再生するかを理解するために重要です。この技術は、その接続または遺伝的プロファイルによって定義される特定の脳領域から記録するためのアクセス可能な方法であり、信号をノイズに分離するための制御が組み込まれています。
プロセッサのデモンストレーションは、私の研究室の大学院生であるエカテリーナ・マルティアノワです。5軸変換器のすべてのネジを緩めることから始めます。パッチコードを5軸変換器に貼り付けたアダプターにネジします。
次に、470ナノメートルの励起光を低電力で点灯し、自動蛍光プラスチックスライドを指すファイバーの先端を配置します。ライブモードでの無料の金属酸化物半導体またはCMOSカメラからの次の記録。目的の焦点に画像が表示されるまで、ゲインを上げるか、ルックアップ テーブルを調整します。
5軸変換器を目的に向けて進め、470ナノメートルの光がパッチコードのSMAまたはFCの端にあるファイバーの中心に置かれ、カメラで画像が解決されるまで確実に進みます。最後に、画像が中央に配置され、適切に解決されるまで、X 軸と Y 軸を調整します。パッチ コードのバリオールの端から放出されるライトを、等方性円として表示されるように視覚化します。
繊維をより良く視覚化するために、すべての励起ライトをオンにすることで開始します。そして、ピクセルが飽和していない、そして繊維の鮮明な画像が存在することを、カメラのゲインを調整します。その後、予備的な画像を撮ります。
繊維の周囲に関心のある領域または ROIS を描画します。録音中の平均強度値の測定のためにそれらを保管してください。複数のファイバー録音の場合、すべてのファイバーからのライブ録音により、独立者をテストします。
光源に向かって 1 本のファイバーを向け、指でタップします。チャネルの変動を観察します。次に、色付きテープを繊維の端に適用して、どの光ファイバに対応する ROI をラベル付けします。
最後に、スタンド、クランプ、ホルダーを使用してアリーナの上にパッチコードを掛けて記録領域を設定します。最後に、動物が繊維の長さによって動きに制限されないことを確認し、アリーナ全体を自由に移動することができます。まず、パッチコードの繊維の遠位端を目で、ミニファイバー顕微鏡で検査します。
繊維の表面に傷が付いている場合は、繊維研磨フィルムを用いて細かいグリットで繊維を再研磨する。その後、70%エタノールとコットンチップアプリケーターでパッチコードの遠位端をきれいにします。70%エタノールと綿の先端アプリケーターを使用して光ファイバーカニューレを洗浄してください。
黒いシュリンクチューブで覆われたセラミックスプリスリーブを使用して、パッチコードのバリオール端を埋め込み型の繊維に接続します。接続中は、袖がしっかりと締め付けされていることを確認します。動物が数分間回復することを許可します。
次に光信号の記録を開始し、実験を実行します。録音中は、ライブトレースに注意深く目を光らせて、品質の録音を確保します。そして、スリーブが十分にタイトではないことを示す、信号の任意のジャンプを見てください。
デュアルカラー記録の場合は、516ナノメートルのLEDをフォトメトリーシステムに追加して、赤色蛍光カルシウムセンサー、適切な二色性ミラーおよびフィルタを励起させます。次に、目的と CMOS カメラの間にイメージ スプリッタを追加して、緑と赤の放出の波長を分離します。最後に、赤と緑の両方の色ですべての繊維の周りにROISを描きます。
対応するファイバとチャネルを使用して、各 ROI を明確に識別してください。470ナノメートルと560ナノメートルのLEDで同時励起をトリガし、410ナノメートルのLEDでそれらを交互にします。結果は、測定された蛍光がLHA-LHB経路の活性化を伴うマウスのエアパフの投与と同時に有意に増加したことを示す。
しかし、緑色蛍光タンパク質またはGFPを発現するマウスでは、エアーパフの投与中にシグナルの変化は検出されなかった。この技術は、研究者が合理的に異なる脳領域内の細胞の特定のタイプから記録することができます.動物が自由に振る舞っている間。
これは、彼らが行動に関連するように、これらの脳領域の機能を解剖する能力をさらに進めます.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
