Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Kvantificering af tumorcellevedhæftning i lymfeknude Cryosektioner
Chapters
Summary February 9th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Her beskriver vi en enkel og billig metode, der gør det muligt at kvantificere klæbende tumorceller til lymfeknude (LN) kryosektioner. LN-klæbende tumorceller er let identificeret ved lys mikroskopi og bekræftet af en fluorescens-baseret metode, hvilket giver en vedhæftning indeks, der afslører tumor celle-bindende affinitet til LN parenkym.
Transcript
De hyppigste steder for metastase er de oprindelige lymfeknuder. Somatids kan bruges til at opdage den klæbende affinitet mellem tumor cells'lymfeknude sektioner in vitro. En fordel ved denne teknik er, at friske lymfeknude sektioner giver en naturlig kompleksitet af det oprindelige væv, som ikke ville være muligt at genskabe ved hjælp af rensede proteiner.
Denne metode kan være nyttig for molekylær onkologi undersøgelser, der søger at identificere gener eller behandlinger, der forstyrrer tumorceller'adhæsion på metastatiske målorganer, ligesom lymfeknuder. At høste lymfeknuder inden for tredive minutter af ofringen, placere den voksne Wistar rotte i dorsal recumbency på en ren dissektion bord ved stuetemperatur og spray pelsen med 70% isopropyl alkohol. Ved hjælp af steriliserede instrumenter, løfte abdominal hud og gøre en mediale hud snit til at afsløre abdominal indvolde.
Uddrag tarmen, indtil bryst-og abdominallymfeknuder bliver synlige. Ved hjælp af stump-tip saks, omhyggeligt punktafgifter lymfeknuder uden at skade den underliggende overlegne mesenteric arterie, og placere lymfeknuden i en 15 ml rør, der indeholder 5 ml steril PBS. Når alle lymfeknuder er høstet, placere en lymfeknude pr cryomold med billedsiden nedad på bunden af hver form og tilføje lige nok optimal skæretemperatur medium til at dække væv.
Efter snap frysning, bruge en kryostat til at erhverve 5 til 8 mikrometer tykke sektioner ved 22 grader Celsius og indsamle sektioner på glas mikroskop dias. God kvalitet krysektioner fra på hinanden følgende skiver af samme lymfeknude er afgørende for at minimere forskelle mellem skiver, og lette konsekvent celle vedhæftning satser. For tumorcelle mærkning, høste celler af interesse fra en passende iscenesat cellekultur og re-suspendere cellerne på en 1 x 10 til 6 celler pr ml koncentration og serum-fri medium.
Cellerne overføres 1 ml celler til et nyt konisk rør på 15 ml, og cellerne med 2 mikrogram pr. ml DiI(C18) overføres i ti minutter ved 37 grader Celsius med forsigtig omrøring ved fem minutter for at undgå cellesedimentering. Ved inkubationens afslutning pellets cellerne ved centrifugering, og de mærkede celler vaskes to gange med 10 ml frisk serumfrit medium for at fjerne overskydende farvestof. Efter den anden vask suspenderes cellerne igen ved en 1 x 10 til de 6 celler pr. ml serumfrit medium suppleret med 0,1 % kvægserumalbuminkoncentration.
Fortsætter af de mærkede tumorceller på de høstede lymfeknuder væv sektioner, forsigtigt vaske sektionerne to gange i PBS, efterfulgt af re-hydrering i frisk PBS i femten minutter ved stuetemperatur. Ved inkubationens afslutning blokeres enhver ikke-specifik binding med 2,5 % kvægserumalbumin i 30 minutter ved 37 grader Celsius, før du bruger en vatpind til at tørre objektglassene. Brug en hydrofobe pen til at tegne en barriere omkring hver sektion og tilsæt 100 mikroliter af mærkede celler på hver omringet lymfeknude.
Efter en til to timer ved 37 grader Celsius i et befugtet kammer fjernes eventuelle celler, der ikke erklæbende, med fire blide vaske i PBS, og de resterende klæbende fluorescensceller fastgør dem med 3,7 % formaldehyd i PBS i femten minutter ved stuetemperatur. Ved kvantificering af klæbeindekset skal du bruge 10x-målet på et fluorescensmikroskop for at opnå individuelle TIFF-billeder af hver sektion i de lyse og røde lysstofrør. Derefter skal du navngive og gemme billederne systematisk, før du åbner billederne i Fiji.
Når vægten er indstillet, skal du bruge det polygonale værktøj til at vælge det område af interesse, der skal kvantificeres. Vælg for at kvantificere lymfeknudeområdet. Dataene udtrykkes i kvadratnillimeter.
Vælg derefter Plugins, Analysér, Celletæller, og klik på det billede, der skal kvantificeres. Klik på Initialiser, og vælg Tællertype. Klik derefter på cellerne på billedet.
Lymfeknude adhæsion indeks vil blive udtrykt som antallet af klæbende tumorceller pr lymfeknude dækket område. Hvis du vil initialisere det næste billede, skal du åbne det næste billede og gentage kvantificeringen som vist. Som observeret afrundes morfologien af de klæbende celler i form, og cellerne er heterogent spredt over hele interesselymfeknuden.
Lymfeknudeindekset er to til tre gange højere i NDRG4 negative brystkræftcellelinjer sammenlignet med det, der måles for tilsvarende NDRG4-positive celler. Denne procedure kan tilpasses til at hjælpe vedhæftning satser i andre metastatiske mål væv, ligesom hjerne eller lunger, at vurdere de sekundære præferencesteder for vedhæftning for insemineret tumorceller. Husk, at både fersk og frosset væv bør betragtes som biofarligt og skal håndteres ved hjælp af passende biosikkerhedsforanstaltninger.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
