טיהור וניתוח מסחטות של האלקאים ושלפוחיות

השדה חוץ-תאי חסר מודל חסר חוליות הניתן למתיחה גנטית כדי לחקור את אותות החלבון וה-RNA של ורים חוץ-תאיים. פרוטוקול זה קובע את השיטות להשגת יבולים חוץ-תאיים שופעים וטהורים מ- C.elegans. זה מספיק עבור RNA-SEQ חזק וניתוח פרוטומי.

כאשר C.elegans תרבות מסונכרנת מיצו את המזון מן צלחת בינונית הצמיחה הרגילה שלהם, להשתמש גומיות כדי להבטיח כובע מסנן רשת ניילון חמישה מיקרומטר על בקבוק סטרילי ולהתחיל ואקום. יוצקים את תולעי L1 על המסנן ומעבירים נפח שווה של בינוני מעל אגרגטים תולעת. לאחר המערבולת, להעביר שלושה 10 כרכים microliter של ההשעיה תולעת על מכסה צלחת טיפוח תולעת לספור את מספר בעלי החיים בכל טיפה.

התאימו את מתלי התולעת לשני בעלי חיים למיקרוליטר של מדיום טרי ומערבולת את ההשעיה שוב. לאחר מכן, להוסיף תשע, 10 טיפות microliter של תולעים על מכסה צלחת חדש באופן ידני לספור את מספר בעלי החיים בכל טיפה. לאחר מכן לחשב את הממוצע ואת השגיאה הסטנדרטית של הממוצע כאחוז של כל אוכלוסיית תולעת ולחשב את המספר הכולל של בעלי חיים בכל אוכלוסייה.

כדי להכין את התולעים לדור secretome, לשטוף את התולעים עם שלוש חמש דקות שוטף ב 15 מיליליטר של מדיום M9 סטרילי עם 50 מיקרוגרם למיליליטר של קרבניצילין לכל צלחת לכל לשטוף עם מערבולת עדינה כדי לנתק את התולעים, בריכת לשטוף לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר. לאחר הכביסה האחרונה, לדלל את התולעים לחיה אחת לכל מיקרוליטר של פתרון S-באזל בתוספת 2.5 מיקרוגרם למיליליטר של כולסטרול ו 50 ריכוז קרבניצילין מיקרומולארי. לאחר מכן להוסיף עד 400 מיליליטר של ההשעיה תולעת לבקבוק סטרילי שני ליטר תחתית מבולבל.

מניחים את הבקבוק על מסובב עגול ב 20 מעלות צלזיוס ו 100 סיבובים לדקה במשך 24 שעות. לקציר חוץ-תאי של רכיים, מעבירים את התולעים בצינור חרוט 50 מיליליטר לצנטריפוגה ומפענחים את העל-טבעי באמצעות מסנן ואקום של 0.22 מיקרומטר כדי להסיר פסולת חלקיקים. לאחר הספירה, מניחים טיפה של תולעים מושעות על מדשאה חיידקית ולהבקיע את בעלי החיים כמו נע, משותק, או מת לאחר 15 דקות.

לאחר מכן, לרכז את supernatant מסונן ל 700 microliters עם מסנן ניתוק משקל מולקולרי 10 קילודלטון מחדש ולהוסיף 150 microliters של פתרון S-באזל טרי להפחתה. סנן ומערבולת את הפתרון שנוצר וחזור על ההפחתה והסינון פעמיים נוספות כפי שהוכח. לאחר הסינון האחרון, צנטריפוגה supernatant כדי להסיר את כל החלקיקים והפסולת שאולי הצטברו במהלך הטיפול ולהוסיף קוקטייל מעכב פרוטאז בתוספת EDTA לפי הוראות היצרן.

כדי להכין את עמודת אי-הכללת הגודל, decant 15 מיליליטר של שף אגרוז מושעה לתוך מחסנית עמוד זרימת כבידה ריקה. כאשר העמודה התנקזה, להוסיף פתרון S-באזל עד מיטת שף הוא ארוז בנפח סופי של 10 מיליליטר. החלף את מאגר שף עם 40 מיליליטר של פתרון S-Basel מסונן סטרילי, דואג לא להפריע את רשף, ולאפשר כוח הכבידה לנקז את המאגר דרך העמודה.

לאחר החלק העליון של הרף כבר לא שקוע, מכסה את החלק התחתון של המחסנית כדי לעצור את הזרימה ולהניח צינור איסוף מתחת לעמודה. כדי ליזום את השבר הסודי, להסיר את הכובע מיד להוסיף את פתרון סודי מרוכז טיפה חכם לחלק העליון של מיטת העמוד, ואחריו תוספת של מיליליטר אחד של S-באזל פתרון טיפה חכם. מניחים צינור איסוף טרי מתחת לעמודה וממלאים באיטיות את מאגר העמודים העליון בחמישה מיליליטר של פתרון S-Basel.

לאחר איסוף שני המיליליטרים הראשונים של eluate, במהירות לשנות את הצינורות כדי לאסוף את ארבעת המיליליטרים הבאים. השתמש nitrocellulose מחדש 10 קילודלטון מסנן ספין ניתוק משקל מולקולרי לרכז את הערכה החוץ תאית המכילה עמודה eluate ל 300 microliters ולהעביר את המסנן לחזור צינור microcentrifuge מחייב נמוך. לאחר מכן לשטוף את קרום המסנן פעמיים עם 100 microliters של פתרון S-Basel ב 20 שניות של מערבולת לכל לשטוף ולשלב את לשטוף עם המקורי retentate עבור נפח מדגם סופי של 500 microliters.

כדי להכין את השלפוחיות החוץ-תאיות לכימות על-ידי ניתוח ציטומטרי של זרימה, הוסיפו 840 מיקרוליטרים של תווי S-Basel ו-60 מיקרוליטרים של שלפוחיות חוץ-תאיות מטוהרות לצינור מיקרוצנטריפוגה. הוסף 300 מיקרוליטרים של המדגם לשני צינורות מיקרוצנטריפוגה נוספים יחד עם שבעה מיקרוליטרים של בדיקה חזקה מתאימה לכל צינור. הוסיפו שבעה מיקרוליטרים של 1%Triton X-100 לצינור האחרון וערבבו את כל הצינורות על ידי מערבולת.

מניחים קצה sonicator במרכז הצינור של המדגם השלישי דופק את המדגם 10 פעמים ב 20% כוח ו 30% מחזור חובה. לאחר מכן, להוסיף 300 microliters של פתרון S-באזל לשני צינורות מיקרוצנטריפוגה בקרה ולהוסיף שבעה microliters של בדיקה לצינור הצבע בלבד. סמן את מאגר הצינור השני בלבד.

ואז להדגר את כל הצינורות במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור לפני הניתוח שלהם על ידי ציטומטריה זרימה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. כדי לנתח את הנתונים, פתח את הקבצים בתוכנת הניתוח הציטומטרי המתאימה לזרימה. הגדר שער מלבני החל בחלק העליון של החלקה המשתרעת ממפלס פיזור האור בזווית קטנה באחת פעמים 10 לשתיים עד פעם אחת 10 לארבע והורדת השער עד שהוא מכיל כ -2.5% מכלל האירועים.

תן שם לשער לאחר הבדיקה והעתק והדבק את השער על שתי החלקות הנתונים האחרות של הדגימה והבקרה. לאחר מכן יצא את הניתוח לגיליון אלקטרוני. כאן מוצגות תוצאות מייצגות של 10 שכפולים ביולוגיים.

השונות בין השכפולים אינה משמעותית והשגיאה הסטנדרטית האופיינית של ממוצע גודל האוכלוסייה היא קצת יותר מ-10% העברת בעלי חיים בין צלחות גורמת לאובדן של כ-10% מבעלי החיים, בעוד כ-20% מבעלי החיים הולכים לאיבוד בשלב ההצף של סוכרוז. בממוצע, 1,000 בעלי חיים צעירים מסוג פראי יפרשו מיקרוגרם אחד של חלבונים הגדולים מ-10 קילו-דלטון לסביבתם. כאשר שבר זה מופרד עוד יותר על ידי כרומטוגרפיה הדרת גודל, פרופיל אלוטיון החלבון הכולל מדגים שיא חלבון קטן בין שניים לשישה מיליליטר ושיא גדול לאחר שמונה מיליליטר.

הווסקולרים החוץ-תאיים כלולים בחמשת המיליליטרים הראשונים של העמודה. בהשוואה ישירה של מאפייני ציטומטריית הזרימה בין C.elegans לבין שלפוחיות חוץ תאיות אנושיות, היסטוגרמה של C.elegans אירועי מדגם שלפוחית חוץ תאית, ממוין על ידי פיזור אור זווית קטן, מראה כי כל ההכנות לשיא בעוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת של כ 1 פעמים 10 לשלישי. בדיקה potentiometric DI-8-ANEPPS, תוויות חזקות C.elegans וויסקלים חוץ תאיים ואת שפע של וויסקלים חוץ תאיים מטוהרים ממוינים על ידי הביטוי DI-8-ANEPPS אינו שונה באופן משמעותי בין C.elegans ותרבות התא נגזר ההכנות.

הדגימות שהוכנו על ידי הליך זה הן נוחות עבור כל שיטות ניתוח שלפוחית חוץ-תאית טיפוסי במורד הזרם, כולל RNA-SEQ, ציטומטריית זרימה, ניתוח מעקב חלקיקים ננו, וניתוח פרוטומי. יצירת שיטות לטיהור וריצים חוץ-תאיים של C.elegans מאפשרת לחוקרים להשתמש במודל חסרי חוליות פשוט זה כדי לחקור את המסלולים הגנטיים והתהליכים הפיזיולוגיים המשפיעים על הרכב מטען דם חוץ-תאי.