간 종양 세포의 맥락에서 자연 킬러 세포 매개 세포 독성 및 이동의 측정

우리는 NK 세포 기능을 공부하는 방법을 보여주는 오늘 두 개의 프로토콜을 시연 할 것입니다. NK 세포 기능의 두 가지 주요 측면은 종양 세포를 근절 할 수 있으며 종양 마이크로 환경으로 마이그레이션 할 수 있습니다. 이 두 프로토콜 우리는 종양 세포를 근절하기 위하여 NK 세포 기능을 보여주고 또한 종양 마이크로 환경으로 이동할 수 있습니다.

따라서 오늘 우리가 보여줄 두 프로토콜은 간단하며, 무선 활동의 사용을 요구하지 않으며 분자 생물학 및 세포 배양 작업을 수행 할 수있는 능력을 가지고있는 대부분의 실험실에서 설립 될 수 있습니다. Suresh Bugide와 Suresh Chava, 내 실험실에서 두 박사 후 동료, 오늘이 두 프로토콜을 시연 할 것 이다. 2명은 LDH를 이용한 NK 세포 중재 세포 독성을 평가하고, 먼저 인간 간암 세포라인을 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 100mm 세포 배양페트리 접시에서 70-80%로 성장한다.

실험 당일, 세포가 플레이트 바닥에서 분리될 때까지 0.25%의 트립신 EDTA의 1밀리리터로 세포를 치료하기 전에 PBS의 5밀리리터로 배양을 세척한다. 단일 세포 현탁액이 수득되면 세포 배양 배지의 10 밀리리터를 세포에 추가하고 원심분리를 위한 15 밀리리터 원모형 튜브로 세포를 이송한다. 신선한 배양 배지 농도의 밀리리터 당 5 세포에 1회 10에 세포를 다시 중단하기 전에 PBS의 5 밀리리터로 세포 펠릿을 세척한다.

다음으로, 표적인간 간암세포의 100마이크로리터를 96웰 플레이트에서 치료조건당 삼중항에 잘 첨가하고, 각 표적세포에 100마이크로리터를 통해 5번째 인간 NK 세포에 1회 10배를 첨가한다. 그런 다음 3 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 인큐베이션의 끝에서, 원심분리에 의해 세포를 펠릿과 새로운 96 웰 플레이트의 개별 우물로 각 우물에서 100 마이크로 리터를 전송.

LDH 기판 50마이크로리터를 철저하게 혼합하여 각 웰에 추가하고 빛으로부터 보호되는 실온에서 20분 동안 플레이트를 배양합니다. 인큐베이션이 끝나면 50마이크로리터의 스톱 용액으로 반응을 체포하고 490 나노미터 및 680 나노미터의 플레이트 판독기의 흡광도를 즉시 측정합니다. 그런 다음 수식을 사용하여 NK 세포 세포 독성%를 계산합니다.

NK 세포 매개 세포 독성을 평가하기 위해 인간 간암 세포 세포 세포를 70-80%로 성장한 후 혈청이 없는 DMEM의 3밀리리터에서 세포를 다시 중단하고 실내 온도에서 30분 동안 10밀리알라 칼세인 AM 용액의 1.5 마이크로리터로 세포를 라벨로 표시하였다. 인큐베이션의 끝에서, 원심 분리에 의해 세포를 수집하고 세척 당 PBS의 다섯 밀리리터와 함께 세포를 두 번 세척. 배양 배지 농도의 밀리리터 당 5세포에 10번으로 세포를 다시 중단하고 치료 조건당 96개의 웰 플레이트에 각각 100마이크로리터의 세포를 첨가한다.

다음으로, 10~5차 인간 NK 세포에서 100마이크로리터의 배양 배지를 각각 표적 세포에 배치하고 4시간 동안 세포 배양 배양에 플레이트를 배치한다. 인큐베이션이 끝난 후, 형광 현미경의 각 복제에 대해 칼세인 AM 양성 세포의 이미지의 적어도 10개의 다른 필드를 10배 배율로 캡처한다. 그런 다음 수식을 사용하여 백분율 세포 독성을 계산합니다.

화학적 자극에 대응하여 NK 세포 이동을 측정하기 위해 인간 NK 세포를 70-80%의 수렴 배양으로부터 수집하고 혈청이 없는 NK 세포 배양 배지 농도의 밀리리터당 6세포당 2.5배 10배에서 세포를 재중단한다. 다음으로, NK 세포 화학요법을 함유한 혈청 없는 배지 600마이크로리터를 첨가하고 직경 5마이크로미터기와 함께 직경 배양 인서트를 1개에 넣고 각 배지의 각 웰에 배치한다. 그런 다음 각 삽입물의 상부 구획에 100 마이크로리터를 추가하고 4시간 동안 세포 배양 배양 인큐베이터에 플레이트를 배치합니다.

인큐베이션의 끝에서 비 부착 이동 세포의 전체 부피를 각각의 바닥에서 개별 5 밀리리터 FACS 튜브로 전송하고 각 튜브에 구슬을 계산하는 소정의 수의 50 마이크로 리터를 추가합니다. 그런 다음 유량 세포계를 사용하여 표준 유량 세포 분석 프로토콜에 따라 각 세포 샘플을 평가하고 수식을 사용하여 마이그레이션된 NK 셀의 절대 수를 계산합니다. ATF4 녹다운은 비특이적 짧은 머리핀 RNA를 발현하는 NK 세포에 비해 NK 세포 매개 세포 독성을 현저히 감소시킨다.

칼세인 AM으로 염색한 후 NK 세포 없이 배양된 인간 간암세포에 비해 인간 NK 세포와 공동 배양후 생존 가능한 인간 간암세포의 수가 감소한다. 예상대로, 짧은 헤어핀 RNA를 통한 ATF4 녹다운은 이러한 배양에서 칼신 AM 양성 세포의 큰 수에 의해 입증된 바와 같이 인간 간 암세포의 NK 세포 중재 살인을 감소시킨다. 또한, 화학세포 없이 제어배지에 노출된 NK 세포에 비해 화학세포 함유 배지에 대한 반응으로 상당히 높은 양의 NK 세포 이주가 관찰된다.

NK 세포 세포 독성 평가에 대 한 우리의 노력 및 대상 비율 및 각 암 세포 줄에 대 한 잠복 시간을 표준화 하는 것이 중요 하다. 시험관 내 평가에서 표준이 확인되고 검증되면 종양 세포 박멸에서의 역할을 더 평가하기 위해 생체 내 마우스 실험으로 보충됩니다.