Attachement covalent de molécules uniques pour la spectroscopie de force basée sur l’AFM

La spectroscopie à force d’une molécule unique nous permet de mesurer les paramètres physiques qui décrivent les propriétés mécaniques et adhésives des polymères. Lors de l’utilisation de la spectroscopie de force basée sur l’AFM pour étudier des molécules simples, il est essentiel d’avoir un protocole fiable et efficace pour lier ces molécules de façon covalente à une pointe en porte-à-faux AFM. Ce protocole peut être adopté pour de nombreux polymères différents indépendamment de la longueur du contour ou de l’hydrophobicité.

Toutes les étapes doivent être effectuées dans une hotte de fumée pour éviter l’inhalation de vapeurs organiques. En outre, le verre résistant aux solvants, le manteau de laboratoire et la protection oculaire sont nécessaires. Utilisez d’abord des pinces fraîchement nettoyées pour placer les copeaux de porte-à-faux AFM dans la chambre plasmatique.

Démarrez le programme d’activation de surface de chambre à plasma en sélectionnant le début et puis oui. Vérifiez que le processus plasmatique fonctionne correctement. Un processus plasmatique à haute teneur en oxygène montre une couleur bleu clair.

Pendant que le programme d’activation de surface est en cours d’exécution, dissoudre silane-PEG-mal en toluène pour obtenir une concentration de 1,25 milligramme par millilitre. Placer trois millilitres de la solution dans une boîte de Pétri plate. Une fois le processus plasmatique terminé, ventiler la chambre plasmatique en sélectionnant confirmer puis évacuer.

Passez immédiatement à l’étape suivante afin d’éviter l’absorption des contaminants. Placez les croustilles dans la boîte de Pétri et incubez les croustilles pendant trois heures à 60 degrés Celsius. Retirer la boîte de Pétri du four et laisser refroidir pendant au moins 10 minutes.

Ensuite, rincez les copeaux. Pour la fixation PEG ou polystyrène, rincer les copeaux avec du toluène trois fois. Pour la reliure en polynipam, les copeaux doivent être rincés une fois avec du toluène et deux fois avec de l’éthanol.

Pour réduire l’impact des forces capillaires sur le porte-à-faux AFM, inclinez légèrement les copeaux lors du rinçage. Les puces en porte-à-faux AFM doivent être rincées correctement pour éliminer tout excès de polymères physiques qui pourrait influencer l’expérience. Le rinçage doit être effectué avec soin afin d’éviter tout dommage aux cantilevers de l’AFM.

Enfin, préparez au moins deux copeaux pour servir de commandes qui ne subiront pas d’attachement au polymère covalent. Pour les commandes par rapport aux copeaux de PEG et de polystyrène, rincer deux fois à l’éthanol et une fois à l’eau. Pour les commandes par rapport aux copeaux de polynipam, rincer deux fois à l’eau.

Pour effectuer l’attachement covalent de PEG ou de polystyrène, préparez trois millilitres de solution polymère en toluène à une concentration de 1,25 milligramme par millilitre. Ajouter la solution et les croustilles dans une boîte de Pétri et incuber les croustilles à 60 degrés Celsius pendant une heure. Après incubation avec peg ou polystyrène, laisser refroidir les copeaux pendant 10 minutes.

Rincer les copeaux deux fois avec du toluène, deux fois avec de l’éthanol et une fois avec de l’eau. Pour effectuer l’attachement covalent du polynipam, préparez trois millilitres de solution de polymère dans l’éthanol à une concentration de 1,25 milligramme par millilitre. Ajouter la solution et les croustilles dans une boîte de Pétri et incuber les croustilles à température ambiante pendant trois heures.

Après incubation avec du polynipam, rincer les copeaux deux fois avec de l’éthanol et deux fois avec de l’eau. Pour conserver les copeaux jusqu’à utilisation dans une expérience, placez chaque puce séparément dans une boîte petri d’un millilitre remplie d’eau. Gardez les boîtes de Pétri à quatre degrés Celsius.

Tout d’abord, insérez la puce en porte-à-faux AFM fonctionnalisée dans un porte-puce. Collez la surface préparée dans un support d’échantillon qui convient aux mesures dans le liquide. Utilisez une pipette pour plonger la puce dans l’eau.

Montez la surface de l’échantillon dans l’AFM. Immerger la surface de l’échantillon dans l’eau. Connectez le porte-puce à l’AFM.

Approchez ensuite la puce à la surface de l’échantillon. Utilisez le panneau environnemental pour régler la température cible et allumer le mode et les boutons de la radio de rétroaction. Ensuite, laissez le système équilibrer pendant environ 15 minutes.

Pour prendre une courbe d’extension de force, approchez la pointe en porte-à-faux AFM vers la surface et sélectionnez une seule force. La courbe résultante affiche la déviation contre la distance piezo avec l’approche de la surface indiquée en rouge et la rétractation indiquée en bleu. Étendre la partie de la courbe qui représente l’indentation de la pointe en porte-à-faux AFM dans la surface sous-jacente.

Pour effectuer un ajustement linéaire, définissez des curseurs sur l’approche ou la courbe de rétractation et sélectionnez la mise à jour INVOLS du menu contexte. La valeur résultante de la valeur de sensibilité inverse du levier optique apparaît dans le panneau en haut à gauche. Après avoir répété cette procédure au moins cinq fois, calculer une moyenne pour la sensibilité inverse du levier optique et entrer la moyenne dans le panneau.

Placez le porte-à-faux AFM à une hauteur d’environ 100 micromètres au-dessus de la surface en sélectionnant le passage au préengager. Pour obtenir un rapport signal-bruit satisfaisant pour le spectre du bruit thermique, réglez le nombre moyen à au moins 10 et choisissez la résolution de fréquence la plus élevée possible. Ensuite, enregistrez le spectre du bruit thermique en sélectionnant les données thermiques de capture.

Pour s’adapter au spectre du bruit thermique avec une fonction d’oscillateur harmonique simple, élargissez la partie de la courbe représentant le premier pic de résonance. Sélectionnez ensuite paraize ajustement. Enfin, affiner l’ajustement en utilisant le bouton de données thermiques ajustement.

La constante de force respective apparaîtra dans le panneau. Pour commencer à collecter les données, définissez les paramètres de l’expérience. Réglez la vitesse de traction à un micromètre par seconde et forcez la gâchette à un nanonewton.

Approchez la pointe en porte-à-faux de l’AFM jusqu’à la surface et sélectionnez une seule force pour enregistrer une seule courbe et déterminer si les paramètres doivent être ajustés comme décrit dans le manuscrit. Sélectionnez la carte F du panneau principal. Pour obtenir une carte de force avec 100 courbes, réglez le nombre de points de force et de lignes de force à 10.

Commencez à enregistrer la carte de force en sélectionnant la carte do F. Prenez les courbes d’extension de force d’une manière de grille-comme pour éviter tous les effets de surface locaux et pour la moyenne différentes zones de surface. Après l’expérience, répétez la détermination de la sensibilité inverse du levier optique et de la constante printanière pour vérifier la cohérence et la stabilité du système.

Les polymères polynipam et PEG simples étaient liés de façon covalente à une pointe en porte-à-faux AFM à une extrémité et physéorbés à la surface du dioxyde de silicium à l’autre extrémité. Pour mesurer le comportement d’étirement dépendant de la température, un événement d’étirement simple molécule clair suivi d’un maximum final à la fin de la courbe d’extension de force respective a été identifié. Ensuite, une seule courbe principale a été générée pour chaque température.

Pour peg, une diminution de la force d’étirement a été observée avec l’augmentation de la température. Pour le polynipam, la tendance inverse a été observée. La désorption du polystyrène à partir d’une surface SAM dans l’eau peut être utilisée pour déterminer la force et la longueur de désorption.

Lorsque l’attachement au polymère a été couronné de succès, les courbes d’extension de force ont montré des plateaux de force constante. Chaque plateau a été équipé d’une courbe sigmoïde pour déterminer la force de désorption et la longueur de désorption. Les forces de désorption observées correspondaient aux valeurs précédemment obtenues.

Lorsque plus d’un polymère attaché à la pointe en porte-à-faux de l’AFM, des cascades de plateaux ont été observées dans les courbes d’extension de force. Avec deux polymères attachés, une distribution bimodale a été trouvée pour la longueur de désorption tandis que la force de désorption a montré une distribution étroite. Une pointe en porte-à-faux AFM fonctionnalisée peut être utilisée pour quantifier la réponse de force de molécules simples dans un environnement liquide et avec des stimuli externes.

L’utilisation d’équipement propre, de solvants, de bouts en porte-à-faux AFM et de rinçage répété est très importante pour atteindre un niveau élevé de propreté qui devrait être confirmé avant les expériences contrôlées décrites. Les protocoles et procédures présentés ont ouvert la voie à une meilleure compréhension des systèmes polymères sensibles aux stimuli. Les résultats peuvent être directement comparés aux simulations dynamiques moléculaires.