使用 iDISCO + 和光片荧光显微镜对脊椎淋巴血管和⁺排水进行三维成像

我们的协议提供椎骨淋巴血管及其排出淋巴结的三维和大规模视图，促进淋巴排水和免疫细胞淋巴流量的研究。iDISCO®清除协议保持组织完整性，允许椎柱的神经、血管和免疫细胞的定位，包括脊髓、脑膜、硬膜外空间和淋巴结的排空。在确认麻醉的8至12周大鼠标对踏板反射缺乏反应后，将鼠标放在立体轴框中。

并使用手术刀在适当的区域进行皮肤切口，用于计划注射。使用脊柱适配器在 Th12-L1 椎骨水平上固定脊髓，并钝解剖覆盖颈部和柱的副脊髓或副脊髓肌肉，以可视化杜拉母体的表面。然后使用 26 量表针仔细点缀杜拉母体的中心区域和下铺设的厌食症。

接下来，从玻璃毛细管尖端切下两毫米，将毛细管连接到连接到 10 微升注射器的管。将微型毛细管装载2至8个微升的荧光示踪剂。并在计划注射的适当角度将微毛细管引入杜拉母体中的中射区域。

将毛细管推至杜拉母体下方 1.5 毫米，用 10 微升手术胶关闭毛细管周围的切口。当胶水干燥时，以每分钟一微升的速度缓慢注射荧光示踪剂。交付整个体积后，请将毛细管留在位一分钟，然后收回微毛细管。

用额外的胶水关闭注射孔。在注射后的适当时间点使用解剖剪刀，使皮肤和腹腔切口从下腹部到胸笼。打开胸腔进入心脏，将 26 量针插入心脏的左心室。

PBS 中用 20 毫升冰冷 4% 半甲醛，速度为每分钟 2 毫升。并使用剪刀快速切割右中庭释放灌注液流。使用钳子完全去除皮肤，用剪刀切除四肢。

切除所有内脏，注意保持淋巴结完好无损，并切开肋骨。将解剖组织浸入PPBS中的冰冷4%半甲醛中，在4摄氏度的单独50毫升管中过夜，然后用50毫升新鲜PBS将固定组织洗涤三次，每次洗涤5分钟。对于全安装样品的 iDISCO® 标记，在 PBS 中连续浸入甲醇浓度上升的组织脱水一小时，在室温下搅拌。

最后一次浸入后，将样品孵育在33%甲醇中，66%的二氯甲烷溶液过夜，搅拌。第二天早上，在室温下，每次洗涤一小时，用100%甲醇清洗样品两次。随后在4摄氏度的甲醇中隔夜孵育5%过氧化氢。

第二天早上，在PBS中甲醇浓度下降的连续浸入中，对样品进行连续补液，每浓度一小时，在室温下搅拌。在室温下，将椎骨解化孵育莫尔斯溶液中的样品30分钟。其次是PBS中的两次冲洗和两次一小时的孵育，在PBS中的0.2%Triton X-100中，在室温下搅拌。

第二次Triton X-100孵育后，在37摄氏度下用渗透溶液处理样品24小时。随后在37摄氏度的阻断溶液中24小时孵育。在阻断溶液孵育标签的末尾，用原抗体对样品进行稀释，在PBS中稀释0.2%Tween-20和0.1%肝素，并在37摄氏度下辅以5%二甲基硫化物和3%驴血清溶液，在37摄氏度下进行6天。

在孵育结束时，在室温下用4至5个隔夜孵育洗涤样品，在室温下用搅拌洗涤，在PBS中用新鲜2%Tween-20和0.1%的肝素进行清洗。然后根据手稿指示用二级抗体孵育样品。上次洗涤后脱水样品，连续浸入PBS中甲醇浓度上升，每次浓度一小时。

随后在33%甲醇66%二氯甲烷溶液中过夜孵育。第二天早上，用两个15分钟的二氯甲烷洗涤样品。在二苯醚中清除样品，四小时不摇晃。

对于光片荧光显微镜成像，将清除的样品置于显微镜阶段的横向平面中，以 4X、0.3 的客观性进行。并选择具有固定 X 位置的单面三张消除配置，无需动态对焦。使用调谐到 561 纳米、100 毫瓦、639 纳米和 70 毫瓦的 LED 激光器。

将光片数值孔径设置为 0.03。设置适当的发射过滤器，用二苯醚填充显微镜室。接下来，使用相机获取具有 2.5 微米 Z 堆栈和每步 30 毫秒曝光时间使用两个 X 光学变焦和 0.8 微米/像素的堆栈。

并执行马赛克采集，整个框架上重叠 10%。获取 TIF 格式的图像，并将其转换为 3D 格式，并采用适当的完整转换软件程序。要使用拼接软件重建马赛克采集，请打开图像并手动排列图像以重新构成整个马赛克图像，使用图像之间的 10% 重叠作为参考。

然后使用 3D 软件生成数据的正交投影。向显示的淋巴血管和其他解剖结构添加颜色代码属性。并设置1.47的伽玛校正，以从光片荧光显微镜获得的原始数据。

根据制造商的说明。iDISCO® 与光片荧光显微镜的结合保留了椎骨解剖结构，并允许捕获周围骨骼、韧带、肌肉和神经神经节内的淋巴血管。注射后45分钟，将小红荧光示踪剂注入脑脊髓液、脊髓的西斯特纳磁石或脊髓的侧光区域，导致深颈淋巴结内示踪剂积累，表明淋巴系统对示踪剂的吸收和排泄。

将跟踪注射到胸腔脊髓膜瘤中会导致脊髓组织内和深颈膜排出淋巴结的示踪积累，但在标有抗LYVE-1抗体的宫颈和胸腔淋巴血管中不会产生跟踪积累。抗LYVE注射到胸椎脊髓膜瘤导致椎骨淋巴及其外椎淋巴连接的标签。证实椎间淋巴血管的示踪剂吸收和淋巴排水对椎外淋巴系统。

非常小心地执行跟踪注射，以免干扰 CSF 循环。iDISCO®协议非常明智，但您需要适应样品的大小。微量注射到中枢神经系统后免疫染色或活成像实验可进行澳大利亚。

iDISCO®协议可用于研究不同的细胞、种群和组织。