Name: 细菌毒素引起的响应，用活细胞荧光显微镜的可视化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 29 s
Description: 了解利用活细胞荧光显微镜可视化免疫细胞对链球菌溶血素O毒素响应的方法。该技术通过微注射器局部递送毒素，实时分析细胞动力学变化，揭示炎症小体激活机制，为免疫学研究提供有力工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢 Richard Rest 慷慨提供炭疽溶素 O，感谢 Michael Caparon 慷慨提供 SLO 质粒，以及感谢 Jonathon Franks 提供的技术支持。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 T32CA82084（PAK）和 R01AI072083（RDS）。

1. 链球菌溶素O（SLO）的纯化
<ol>
	<li>将含有 pBADgIII-SLOhis 质粒9 的 BL21 GOLD 细菌的 20 ml 过夜培养物接种至 0.5 L LB 液体培养基中，并加入 500 μl 50 mg/ml 氨苄青霉素。在 37 °C、225 rpm 条件下振荡培养，直至 OD600 = 0.6（通常约 1.5 小时）。取 1 ml 细菌（记为 T0）在 10,000 × g 条件下离心 5 分钟，将沉淀溶解于 140 μl 1× SDS 样品缓冲液/1 OD 中，并进行超声处理以剪切 DNA，用于蛋白质纯度分析。</li>
	<li>向培养物中加入 5 ml 20% 阿拉伯糖以诱导表达，在室温下以 225 rpm 振荡培养 3 小时。收集 1 ml 细菌，离心后按上述方法溶解于 1× SDS 样品缓冲液中，作为 T3 时间点样品用于纯度分析。</li>
	<li>将剩余细菌收集至 500 ml 离心瓶中，在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 12 分钟（Sorvall GS-3 转子，8,500 rpm）。弃去上清液，如需可将沉淀在 -80 °C 保存过夜或更长时间。</li>
	<li>将冷冻的沉淀在冰上用 10 ml 裂解/洗涤缓冲液（50 mM NaH2PO4、300 mM NaCl、10 mM 咪唑，pH 8.0）重悬，并加入 400 μl 25% Triton X-100、100 μl 100 mg/ml 溶菌酶和 50 μl 200 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）。将重悬后的沉淀转移至 50 ml Oak Ridge 管中。</li>
	<li>在冰上对裂解液进行 5 次超声处理，每次 30 秒，间隔 30 秒。将超声处理后的裂解液在 Oak Ridge 管中于 4 °C 以 39,000 × g 离心 20 分钟（Sorvall SS-34 转子，18,000 rpm）。</li>
	<li>在裂解液离心的同时，用 10 ml 裂解/洗涤缓冲液洗涤 1 ml Ni-NTA 琼脂糖，于 4 °C 以 1,200 rpm 离心 5 分钟（后续所有洗涤和洗脱步骤均采用此离心条件）。吸除洗涤液。</li>
	<li>将步骤 1.5 中获得的细菌上清液加入 Ni-NTA 琼脂糖中，在 4 °C 轻柔振荡 2.5 小时。离心收集上清液。取 30 μl 上清液与 10 μl 4× SDS 样品缓冲液混合，保存用于纯度分析。用裂解/洗涤缓冲液洗涤琼脂糖珠 4 次，再用 Tris/盐缓冲液（50 mM Tris、300 mM NaCl，pH 8.0）洗涤 1 次。</li>
	<li>每次加入 1 ml 洗脱缓冲液（Tris/盐缓冲液中含 250 mM 咪唑）和 5 μl 1 M 二硫苏糖醇（DTT）至琼脂糖珠中，冰上孵育 10 分钟，离心并收集上清液，共洗脱 3 次。SLO 是一种对氧化还原状态极为敏感的蛋白质，必须始终置于冰上。一旦被还原，即使短暂升温至 37 °C，蛋白质也会迅速失活。</li>
	<li>用洗脱缓冲液洗涤 500 μl 多粘菌素偶联琼脂糖，在 4 °C 以 10,000 × g 离心 1 分钟，重悬于 500 μl 缓冲液中。为去除内毒素，向每次洗脱液中加入 200 μl 琼脂糖珠，在 4 °C 振荡 30 分钟。在 4 °C 以 10,000 × g 离心 1 分钟，保留上清液。取每次洗脱液 30 μl 与 10 μl 4× SDS 样品缓冲液混合，用于 SDS-PAGE 分析。</li>
	<li>通过 SDS-PAGE 检测洗脱液的纯度。将用于凝胶分析的样品在 95 °C 煮沸 5 分钟，取 10 μl 上样至 10% 凝胶。用考马斯亮蓝染色以观察蛋白质条带（图 2A）。SLO 分子量为 69 kDa。采用 Bradford 法测定蛋白浓度（前两次洗脱液的典型产量为 4 mg/ml，但可能因菌株和质粒不同而有所差异）。</li>
	<li>检测每次洗脱液的溶血活性（见下文）。将纯度、浓度和溶血活性均达标的洗脱液合并。将 SLO 分装为单次使用量（通常为 5–10 μl），在干冰上速冻后于 -80 °C 保存。</li>
</ol>
2. 溶血实验
<ol>
	<li>用RBC检测缓冲液（0.3% 牛血清白蛋白（BSA）、2 mM CaCl2、10 mM Hepes，pH 7.4）洗涤羊红细胞（RBCs），在1,200 rpm下离心5分钟，然后将红细胞重悬于10 ml RBC检测缓冲液中，终浓度为2.5%。</li>
	<li>在冰上将96孔V型底板每孔加入10 μl RBC检测缓冲液。每个洗脱液样品做复孔并进行系列稀释，典型稀释范围为1:1,000至1:512,000。设置3个无毒素孔作为阴性对照，3个每孔加入10 μl 2% Triton X-100的孔作为最大裂解对照。</li>
	<li>盖好板后于37 °C孵育30分钟，以1,200 rpm离心5分钟。将70 μl上清液转移至平底96孔板，测定A405。一个活性单位定义为引起50%红细胞裂解所需的毒素稀释度。毒素活性计算公式为：1单位×稀释倍数/0.01 ml。</li>
</ol>
3. 细胞裂解实验
<ol>
	<li>收集细胞，计数，离心。用缓冲液 R/B（含 2 mM CaCl2 和 0.5% BSA 的 RPMI 培养基）重悬细胞至浓度为 2×106/ml，并加入 20 μg/ml 碘化丙啶。取 100 μl 细胞悬液加入 96 孔 V 型底板中。</li>
	<li>用缓冲液 R/B 将 SLO 连续稀释至终浓度的 2 倍，然后向细胞中加入 100 μl 毒素溶液或 100 μl 缓冲液 R/B。37 °C 孵育 5 分钟。通常的终浓度范围为 2,000 U/ml 至 31.25 U/ml。</li>
	<li>将细胞上流式细胞仪，使用藻红蛋白（PE）滤光片收集数据。一个对数级位移代表暂时性通透化的细胞，而三个对数级位移则表示死亡细胞4。通过从实验组的死亡细胞百分比（%PIhighexp）中减去对照组的死亡细胞百分比（%PIhighctl），计算细胞的特异性裂解率，公式如下：特异性裂解率 = (%PIhighexp - %PIhighctl) / (100 - %PIhighctl) × 100</li>
</ol>
4. 向培养皿中的细胞进行微量移液器递送毒素
<ol>
	<li>实验前一天，将 2×105 个巨噬细胞接种于胶原包被的玻璃底 35 mm 培养皿中。</li>
	<li>开启显微镜和显微注射仪。使加热载物台预热至 37 °C。显微镜的选择通常取决于本地可用设备。所需显微镜应具备倒置平台、可将培养皿加热至 37 °C 的载物台、适用于所选染料的激发/发射滤光片组，以及可物理连接显微注射仪的空间。配备伯特兰透镜（Bertrand lens）有助于显微注射操作，但非必需。驱动显微镜的计算机需具备足够的内存以采集和存储数据。</li>
	<li>在 37 °C 条件下用染料对细胞标记 30 分钟。根据实验类型，可使用 5 μl Fura2 AM 加入 1 ml PBS 中，或 2 μl calcein AM 加入 1 ml 完全培养基中进行染色。对于 Fura2，采集 340/510 nm 和 380/510 nm 的激发/发射信号，340/380 信号的比值用于确定钙离子流。对于 calcein，激发/发射波长为 495/515 nm；ethidium homodimer 为 525/620 nm；APC 为 650/660 nm。也可选择其他标记物。</li>
	<li>用 PBS 洗涤细胞后，加入 1 ml 含 2 mM CaCl2 的 RPMI 培养基。将培养皿置于显微镜载物台上。</li>
	<li>将毒素和葡聚糖溶于水中，并在 4 °C 条件下以 20,000 × g 离心 10 分钟。通常将 1 μl SLO 和 4 μl 10 mg/ml dextran-555 溶于 6 μl 水中。使用葡聚糖或其他荧光液相分子可验证飞秒移液尖端（femto-tip）未堵塞，并能按预期注射。</li>
	<li>使用微量移液器（microloader）从后端向飞秒移液尖端加载 0.07 μl 稀释后的毒素。</li>
	<li>将飞秒移液尖端安装到显微注射仪上。调整注射仪角度，使尖端位于细胞中心上方，并留有在各个方向移动的空间。清除 z 轴限位。注射参数应设置为：120 psi 压力下注射 0.5 秒，背压为 20 psi。降低尖端直至其进入培养液中。</li>
	<li>使用伯特兰透镜将尖端居中，并在降低过程中追踪其位置。一旦失去焦点，切换回常规光学模式。针尖阴影应在视野中清晰可见。先对焦于细胞上方，再降低针头直至其进入焦点。重新对焦于细胞，小心地将针头移至细胞旁。设定注射的 z 轴限位。开始成像，将针尖移至目标位置，在预定时间点注射以释放毒素。注射后抬起针头，移至另一区域的细胞进行下一次注射。完成操作后将针头移回原位，防止毒素从针头意外泄漏。</li>
</ol>

<ol><li>Walev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3185-3190 (2001).</li>
<li>Walev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+regulates+IL-1+beta+processing+via+calcium-independent+phospholipase+A2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Potassium regulates IL-1 beta processing via calcium-independent phospholipase A2.</a> J. Immunol. 164, 5120-5124 (2000).</li>
<li>Scolding, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+removal+by+oligodendrocytes+of+membrane+attack+complexes+formed+by+activated+complement%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vesicular removal by oligodendrocytes of membrane attack complexes formed by activated complement.</a> Nature. 339, 620-622 (1989).</li>
<li>Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptolysin+O+clearance+through+sequestration+into+blebs+that+bud+passively+from+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Streptolysin O clearance through sequestration into blebs that bud passively from the plasma membrane.</a> J. Cell. Sci. 124, 2414-2423 (2011).</li>
<li>MacKenzie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+secretion+of+interleukin-1beta+by+microvesicle+shedding%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Rapid secretion of interleukin-1beta by microvesicle shedding.</a> Immunity. 15, 825-835 (2001).</li>
<li>Qu, Y., Franchi, L., Nunez, G., Dubyak, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonclassical+IL-1+beta+secretion+stimulated+by+P2X7+receptors+is+dependent+on+inflammasome+activation+and+correlated+with+exosome+release+in+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nonclassical IL-1 beta secretion stimulated by P2X7 receptors is dependent on inflammasome activation and correlated with exosome release in murine macrophages.</a> J. Immunol. 179, 1913-1925 (2007).</li>
<li>Andrei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipases+C+and+A2+control+lysosome-mediated+IL-1+beta+secretion%3A+Implications+for+inflammatory+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Phospholipases C and A2 control lysosome-mediated IL-1 beta secretion: Implications for inflammatory processes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 9745-9750 (2004).</li>
<li>Franchi, L., Eigenbrod, T., Munoz-Planillo, R., Nunez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammasome%3A+a+caspase-1-activation+platform+that+regulates+immune+responses+and+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The inflammasome: a caspase-1-activation platform that regulates immune responses and disease pathogenesis.</a> Nat. Immunol. 10, 241-247 (2009).</li>
<li>Magassa, N., Chandrasekaran, S., Caparon, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pyogenes+cytolysin-mediated+translocation+does+not+require+pore+formation+by+streptolysin+O%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pyogenes cytolysin-mediated translocation does not require pore formation by streptolysin O.</a> EMBO Rep. 11, 400-405 (2010).</li>
<li>Pinkney, M., Beachey, E., Kehoe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thiol-activated+toxin+streptolysin+O+does+not+require+a+thiol+group+for+cytolytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">The thiol-activated toxin streptolysin O does not require a thiol group for cytolytic activity.</a> Infect. Immun. 57, 2553-2558 (1989).</li>
<li>Watkins, S. C., Salter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+connectivity+between+immune+cells+mediated+by+tunneling+nanotubules%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Functional connectivity between immune cells mediated by tunneling nanotubules.</a> Immunity. 23, 309-318 (2005).</li>
<li>McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patching+plasma+membrane+disruptions+with+cytoplasmic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane.</a> J. Cell. Sci. 113, 1891-1902 (2000).</li>
<li>Shannon, J. G., Ross, C. L., Koehler, T. M., Rest, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+anthrolysin+O%2C+the+Bacillus+anthracis+cholesterol-dependent+cytolysin%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Characterization of anthrolysin O, the Bacillus anthracis cholesterol-dependent cytolysin.</a> Infect. Immun. 71, 3183-3189 (2003).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本文所述技术可用于检测免疫细胞对细菌毒素的反应。其中最关键的步骤是毒素的处理与给药。由于毒素性质脆弱，即使同一制备样品的不同等分试样之间，其活性也可能存在极大差异。因此，必须对每份毒素等分试样使用参考细胞系或红细胞进行活性测试，或采用毒素浓度梯度法。通过微量移液器施加的毒素浓度梯度可在实时观察中呈现毒素诱导的全部生物学效应，但该方法不适用于生化分析。
微量移液器递送毒素可能具有挑战性。然而，与标准的显微注射不同，本实验无需刺入细胞内部。事实上，必须注意避免针头本身损伤细胞，因为这会引发类似的膜修复反应12。特别是在免疫细胞中，针头接触所产生的钙信号会通过纳米管在培养物中的其他细胞间传播11。不刺入细胞还可延长针头的使用寿命。同样，使用伯特兰透镜（Bertrand lens）观察针头下降至细胞的过程，可减少微量移液器定位的不确定性。尽管受损的针头比完好的针头释放毒素更快，但仍可用于生成初步结果。微注射系统允许多次注射，以便获得更高的毒素梯度。或者，也可通过调整注射持续时间来改变递送剂量。该微注射系统还允许在同一培养皿内进行多个实验。此外，...

<table><tbody><tr><td>Ni-NTA 琼脂糖</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>多粘菌素-琼脂糖</td><td>Sigma</td><td>P1411-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Zeba脱盐离心柱</td><td>Fisher</td><td>PI-89891</td><td></td></tr><tr><td>绵羊红细胞</td><td>Fisher</td><td>50-415-688</td><td></td></tr><tr><td>pBADgIII-SLO</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>参见参考文献&lt;sup&gt;9&lt;/sup&gt; </td></tr><tr><td>Cy5单反应性染料</td><td>GE Healthcare</td><td>PA25001</td><td></td></tr><tr><td>Fura2-AM</td><td>Life Technologies</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>钙黄绿素 AM / 碘化丙啶均聚物</td><td>Life Technologies</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>抗-CD11c-APC</td><td>BD Biosciences</td><td>550261</td><td></td></tr><tr><td>胶原蛋白包被的玻璃底培养皿</td><td>Mattek</td><td>P35GCol-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>femto-tip II</td><td>Fisher</td><td>E5242957000</td><td></td></tr><tr><td>显微操作加样器</td><td>Fisher</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555 葡聚糖</td><td>Life Technologies</td><td>D34679</td><td></td></tr><tr><td>Injectman NI 2</td><td>Eppendorf</td><td>920000029</td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet</td><td>Eppendorf</td><td>5247 000.013</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;表1.&lt;/strong&gt; 特定试剂与设备清单及来源。本方案中所使用的特定设备和试剂，包括公司名称和货号，均已列出。&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;表格 边框=&quot;1&quot;&gt; &lt;tbody&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;缓冲液&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;成分&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;步骤使用&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;裂解/洗涤&lt;/td&gt; &lt;td&gt;50 mM NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 300 mM NaCl&lt;br/&gt; 10 mM 咪唑，pH 8.0&lt;/td&gt; &lt;td&gt;1.4&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;Tris/盐&lt;/td&gt; &lt;td&gt;50 mM Tris，pH 8.0&lt;br/&gt; 300 mM NaCl&lt;/td&gt; &lt;td&gt;1.7&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;洗脱缓冲液&lt;/td&gt; &lt;td&gt;50 mM Tris，pH 8.0&lt;br/&gt; 300 mM NaCl&lt;br/&gt; 250 mM 咪唑&lt;/td&gt; &lt;td&gt;1.8&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;红细胞检测缓冲液&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.3% BSA&lt;br/&gt; 2 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 10 mM HEPES，pH 7.4&lt;/td&gt; &lt;td&gt;2.1&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;缓冲液 R/B&lt;/td&gt; &lt;td&gt;RPMI 细胞培养基&lt;br/&gt;2 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 0.5% BSA&lt;/td&gt; &lt;td&gt;3.1&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;/tbody&gt; &lt;/table&gt; </td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;细菌毒素与细胞膜中的胆固醇结合，形成允许细胞内容物泄漏和外部物质内流的孔道。细胞可能通过主动的膜修复过程从这种损伤中恢复，也可能死亡，具体结果取决于毒素暴露剂量和细胞类型1。此外，这些毒素通过激活免疫细胞（包括巨噬细胞）诱导感染宿主产生强烈的炎症反应，巨噬细胞可产生多种促炎性细胞因子2。许多革兰氏阳性菌可产生结合胆固醇的毒素，这些毒素已被证明可通过尚未完全明确的机制增强其毒力。细胞暴露于此类毒素后，质膜会出现形态学改变，例如毒素被隔离至富含胆固醇的细胞表面突起中，这些突起可被释放到细胞外空间，提示存在一种内在的细胞防御机制3,4。该过程可在无代谢活性的细胞上发生，并可通过化学固定后的电镜观察4。在响应毒素刺激而介导炎症的免疫细胞（如巨噬细胞）中，诱导产生的膜囊泡可能含有IL-1家族细胞因子，或同时参与毒素清除和促炎细胞因子的扩散5,6,7。已有研究提示IL-1β的释放与一种特定类型的细胞死亡（称为焦亡）相关，因为两者均为caspase-1依赖性过程8。为了阐明巨噬细胞对毒素的复杂反应机制（包括毒素结合、膜囊泡脱落、细胞因子释放以及潜在的细胞死亡），我们开发了标记技术与荧光显微镜方法，可实时观察毒素与细胞的相互作用，并检测细胞功能障碍与死亡（图1）。由于其他技术存在局限性，活细胞成像的使用尤为必要：生化方法无法解析单个细胞中的效应，而流式细胞术无法提供对单个细胞的高分辨率实时可视化观察。本文所述方法可用于分析其他刺激物诱导的涉及复杂细胞表型变化的动态反应。&quot;&gt;&lt;strong&gt;表2.&lt;/strong&gt; 本方案中所用缓冲液列表。列出了所使用的缓冲液、其组成成分以及在本方案中首次使用的步骤。&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

使用活细胞荧光显微镜观察细菌毒素诱导的细胞反应

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

细菌毒素与细胞膜中的胆固醇结合，形成孔道，导致细胞内容物泄漏以及胞外物质内流。细胞可能通过主动的膜修复过程从这种损伤中恢复，也可能死亡，具体结果取决于毒素暴露量和细胞类型1。此外，这些毒素通过激活免疫细胞（包括巨噬细胞）在感染宿主中引发强烈的炎症反应，巨噬细胞会释放多种促炎性细胞因子2。许多革兰氏阳性菌可产生结合胆固醇的毒素，已被证实可通过尚不明确的机制增强其毒力。
细胞暴露于这些毒素后，其质膜会发生形态学改变，包括被隔离到富含胆固醇的细胞表面突起中，这些突起可被释放到细胞外空间，提示存在一种内在的细胞防御机制3,4。该过程在无代谢活性的情况下即可发生于所有细胞，可通过化学固定后的电镜观察进行可视化4。在响应毒素暴露而介导炎症反应的免疫细胞（如巨噬细胞）中，诱导产生的膜性小泡可能含有IL-1家族的细胞因子，或同时参与毒素的清除以及这些促炎性细胞因子的扩散5,6,7。已有研究提示IL-1β的释放与一种特定类型的细胞死亡（称为焦亡）之间存在关联，因为二者均为依赖caspase-1的过程8。为了阐明巨噬细胞这一复杂反应（包括毒素结合、膜性小泡脱落、细胞因子释放以及潜在的细胞死亡）的机制，我们开发了标记技术及荧光显微镜方法，可实现对毒素与细胞相互作用的实时可视化观察，包括细胞功能障碍和死亡的检测（图1）。由于其他技术存在局限性，活细胞成像的使用尤为必要。生化方法无法解析单个细胞内的效应，而流式细胞术则不能提供对单个细胞的高分辨率、实时可视化观察。本文所述方法亦可用于分析其他刺激物诱导的、涉及复杂细胞表型变化的动态响应过程。

通常，当蛋白浓度为 4 mg/ml 时，可获得 107-108 U/ml 的 SLO。不同细胞类型裂解所需的毒素量有所不同，但通常为 125–500 U/ml SLO（图 2B）。某些细胞类型（如巨噬细胞）可能更具抗性（4000 U/ml），而其他细胞（尤其是 T 细胞系）则更为敏感。这些敏感性与市售 SLO 的活性一致。每次冻融后，毒素活性大约下降 2 倍，因此需要对每批或每次解冻的毒素进行溶血活性检测，以确认其活性。此外，在缺乏含胆固醇膜的情况下，该毒素对热和氧化极为敏感10，因此操作该蛋白时需格外小心。
通过微递送毒素，可以在同一培养皿中比较未处理细胞与毒素处理细胞的情况。同时，由于从微移液管尖端会形成扩散梯度，该方法也为毒素活性提供了内部对照。靠近微移液管尖端的区域将出现细胞死亡，表现为钙黄素信号丢失和乙啶同二聚体摄取，而远离尖端的区域则无损伤表现（图3）。鉴于所用毒素的强效性，即使在施加反向压力的情况下，微移液管尖端渗漏的微量毒素也可能在移...

本文描述了从重组大肠杆菌（E. coli）中纯化胆固醇结合毒素链球菌溶素O的方法，以及该毒素与活体真核细胞结合的可视化技术。局部递送毒素可诱导靶向细胞发生快速而复杂的改变，揭示了毒素生物学的新特征。

细菌毒素与膜中的胆固醇结合，形成孔道，导致细胞内容物泄漏以及外部物质进入细胞。

本实验的目的是观察免疫细胞对细菌毒素的反应。首先，在BL 21 gold细胞中表达并纯化毒素。在确认毒素活性和浓度后，将毒素递送至免疫细胞。使用显微注射仪并结合高速活细胞显微成像技术进行观察。对所获得图像的分析揭示了免疫细胞对毒素反应的实时动力学过程。该方法有助于解答免疫学领域中的关键问题，例如炎症小体激活的机制。尽管该方法可用于研究毒素介导的免疫细胞反应，但也适用于其他刺激物，包括趋化性引诱物。我们最初在研究细菌与培养的免疫细胞相互作用时提出了该方法，当时观察到细菌与免疫细胞之间的相互作用具有高度变异性。使用含有PAG三个SLO的BL 21 gold细胞培养物开始链球菌溶素O（strep lysin O）或SLO的纯化。将他的质粒培养至 OD 值约为 0.6。为诱导蛋白表达，向培养物中加入 5 毫升 20% 的 OSes，于室温下以 225 转/分钟振荡培养 3 小时。接着，将细菌转移至 500 毫升离心管中。然后在4°C条件下，以12,000 × g离心培养物12分钟，离心后弃去上清液。将沉淀置于-80°C下过夜或更长时间保存。为纯化表达的SLO，向冻存的沉淀中加入10毫升洗涤缓冲液，并补充Triton X-100、溶菌酶和苯甲基磺酰氟，用移液器上下吹打约15分钟。进行重悬时，将沉淀物悬浮并保持样品置于冰上。将重悬后的沉淀物转移至一个50毫升橡树岭圆底聚丙烯管中。使用探头式超声仪在40%输出功率下对裂解液进行超声处理，每次30秒，共重复5次，每次间隔30秒，并在两次超声之间将样品置于冰上冷却30秒。然后在 4°C 条件下，以 39,000 × g 离心超声裂解液 20 分钟。离心后，将细菌上清液加入 1 毫升经洗涤的镍 NTA 琼脂糖中。将镍 NTA 琼脂糖与裂解液在 4°C 轻柔振荡孵育 2.5 小时。在4°C条件下，以400 × g离心5分钟，使磁珠沉淀。请注意，后续所有洗涤和洗脱步骤均采用此离心条件，除非另有说明。离心结束后。取30微升上清液与10微升4倍SDS上样缓冲液加入微量离心管中，混匀后置于冰上，用于纯度分析。随后弃去剩余的上清液，并用裂解洗涤缓冲液洗涤磁珠4次，每次洗涤之间使用高盐缓冲液进行离心。从此时起，务必始终将样品置于冰上操作。SLO 是一种对氧化还原状态极为敏感的蛋白质，即使短暂升温至 37 摄氏度，也会迅速丧失其活性。为洗脱 SLO 蛋白，向珠粒中加入一毫升洗脱缓冲液和五微升一摩尔的 DTT，冰上孵育 10 分钟。然后离心，并将上清液收集到标记有洗脱编号的离心管中。重复此步骤三次后，为去除SLO蛋白中的内毒素，向样品中加入200 µL已洗涤的聚混合偶联琼脂糖珠（agro beads），该珠子悬浮于res盐缓冲液中，然后在4°C下振荡30分钟。随后在4°C下以10,000 × g离心1分钟。离心后，将上清液收集至新的已标记的微量离心管中。将每次洗脱的30微升与10微升的4倍SDS上样缓冲液混合。进行SDS-PAGE分析时，将SLO溶液置于冰上保存。测定蛋白浓度和溶血活性，若结果满意，则将SLOE分装为5至10微升的等份，随后在干冰上速冻，并于-80摄氏度保存。然后测定特异性裂解率。Reese。将待测细胞在缓冲液RB中以每毫升20微克的浓度重悬两次，每毫升含六百万个细胞。碘化丙啶。此处检测 T 27 A 细胞。将 100 微升细胞分别加入 96 孔 V 型底板的每个孔中，每孔细胞置于单独的微量离心管内。用缓冲液rb将SLO连续稀释至终浓度的两倍。然后向细胞中加入100微升毒素或100微升缓冲液RB，在37摄氏度孵育5分钟。典型的终浓度范围为每毫升2000单位至每毫升31.25单位。使用流式细胞仪运行细胞，并用针对fi、cethrin或pe的滤光片收集数据。一个对数级移位代表瞬时通透性细胞，而三个对数级移位表明细胞死亡。通过从实验组中减去对照组的细胞死亡百分比，利用此处所示公式计算细胞的特异性裂解率。在实验前一天铺板，将五倍中心的巨噬细胞置于胶原包被的玻璃上。底部为35毫米的培养皿。用于毒素递送的显微镜应配备倒置载物台、加热载物台、合适的激发-发射滤光镜组，以及如有条件，应配备伯特兰透镜。该操作过程中最困难的部分是将针头完整地降至细胞位置。为了确保成功，我们使用贝特兰透镜（Bertrand lens），该透镜通常用于对准，以便在将针穿过焦平面时观察针的位置。显微镜应连接显微注射仪，并由一台具有足够内存的计算机控制，以采集和存储数据、开启显微镜和显微注射仪，并在等待载物台加热的同时，使加热载物台有足够时间升温至37°C。在37°C条件下，用染料对细胞标记30分钟。根据实验要求，标记时可使用五微升、四微升或凌晨两点在一千微升 HBSS 中，或在一千微升完全培养基中加入两微升钙指示剂，此处使用四微升或两微升。移除细胞培养基，并用 PBS 洗涤细胞一次。吸除 PBS，加入一千微升 RPMI 培养基，其中添加二毫摩尔氯化钙。将培养皿安装到显微镜上，使用明场使细胞对焦，然后调整焦距至略高于细胞的位置。接着，取一微升 SLO 毒素、四微升浓度为 10 毫克/毫升的 DEXTRA 5 55 以及六微升水进行混合。然后，在 4 摄氏度条件下，以 20,000 × g 离心 10 分钟。使用葡聚糖可验证飞升移液尖端是否未被堵塞。使用微量移液器从后端向飞升移液尖端中加入两微升稀释的毒素。将飞升移液尖端安装到显微注射仪上。然后调整注射器的角度，使针尖位于细胞中心上方，并留有在各个方向移动的空间。清除Z轴限位的先前设置，该限位用于控制显微注射针尖下降的最低位置。将显微注射仪设置为在120 PSI压力下注射0.5秒，反向压力为20 PSI。然后降低针尖，直至其进入培养基中。使用 Bertrand 透镜。将针尖居中，并在针尖逐渐靠近细胞时持续追踪。一旦针尖偏离焦点，立即切换回常规光学模式。视野中应能清晰看到针头的阴影。先将焦点置于细胞上方，然后降低针头直至其进入焦点范围。接着调整细胞至清晰对焦，并小心地将针头移至靠近某个细胞的位置。设定注射的Z轴限制后，开始成像并注射毒素。然后抬起针头，移动至新的细胞区域。再次注射毒素，并在注射后继续成像。使用本视频中所述的方法将针头移至初始位置，以防止针头发生任何意外的毒素泄漏，毒素浓度为每毫升10的7次方至10的8次方单位。SLO通常在蛋白浓度为每毫升4毫克时获得。此SDS-PAGE凝胶显示了毒素诱导前后以及纯化后的细菌样品，三次考马斯亮蓝染色结果均表明，诱导表达的SLO已成功纯化。SLO 是指分子量为 69 千道尔顿的条带，用于确定裂解 T 27 A 或 D 两种细胞所需的毒素量。在 37 摄氏度下，用不同浓度的 SLO 处理细胞 5 分钟，同时加入碘化丙啶，随后通过流式细胞术进行检测。特异性裂解率的测定方法如图所示。每毫升250单位。SLO对T 27 A和D两种细胞均能产生50%的裂解。毒素的亚裂解剂量（10%裂解）为每毫升62.5单位。这些数值对于评估毒素暴露后细胞死亡的基准毒素活性具有重要意义。人皮肤成纤维细胞使用 Life Technologies 公司的活死细胞检测试剂盒，与钙离子和 atherium 同源二聚体共同孵育。在局部暴露于细菌毒素 anthro lysin O 后，在此图像中，钙离子显示为绿色，靠近微生物组的区域中 atherium 溴化物显示为红色，表现出以钙流失和 athe 同源二聚体摄取为特征的细胞死亡；而远离尖端的区域则无损伤表现。毒素的微量递送还允许检测钙流等实时事件。这些负载了4:02 AM的人源树突状细胞在恒定流速下暴露于SLO，同时进行活细胞成像，观察到荧光信号由绿色向蓝色转变。伪彩显示细胞质钙水平升高。SLO 会引发胞质钙离子的快速增加，由于局部递送，这种增加会在培养皿区域内传播。然而，只有靠近微注射器尖端的细胞才会接触并响应毒素。这既展示了单个细胞对毒素的反应，也体现了毒素递送在空间上的局限性，从而可在 zdi 维度上解析事件。微递送技术与高速三维共聚焦显微镜相结合。这组图像显示了毒素注射后树突状细胞的反应。这些细胞预先与绿色荧光标记的抗CD11c抗体（与PC偶联）孵育，以标记细胞膜。如图所示，微囊泡在毒素递送后被释放。作为细胞修复过程的一部分，毒素分子会富集于膜出泡处，并通过脱落这些出泡来清除毒素。一旦掌握，显微镜观察可在45分钟内完成。在进行该实验操作时，务必记住在与细胞混合前保持毒素处于低温环境，并检测其溶血活性。很好。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用活细胞显微镜技术实时测量免疫细胞对细菌毒素的反应动力学。

visualization-bacterial-toxin-induced-responses-using-live-cell

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

细菌毒素引起的响应，用活细胞荧光显微镜的可视化

本文展示了在活体细菌细胞上进行单分子荧光显微镜观察的实验方案，以实现对功能性分子复合物的检测、追踪和定量分析。...

可视化单个分子复合物 在体 内 使用先进的荧光显微镜技术

来源：Brzozowski, R. S. et al. 利用活细胞荧光显微镜研究细菌中亚细胞蛋白定位及细胞形态变化。J. Vis. Exp.

利用活细胞荧光显微镜成像观察细菌的形态学变化

来源： Chetrit, D., 等结合活细胞成像与冷冻电子断层扫描技术解析时空动态特征 嗜肺军团菌 Dot/Icm 分泌系统 视频实验杂志.

荧光标记细菌的样品制备与成像

我们描述了一种用于追踪由胞内细菌引发的内膜系统破裂的方法 志贺氏菌 福氏 和 结核分枝杆菌...

由胞内病原体引起的液泡破裂的单细胞测量

通过III型分泌系统将效应蛋白转运至宿主细胞是革兰氏阴性菌中一种常见的毒力策略。本研究采用基于β-内酰胺酶效应蛋白融合的检测方法，对转运过程进行定量分析。在感染了Yersinia的细胞中，通过激光扫描显微镜监测β-内酰胺酶对FRET报告分子的转化作用。...

分析 小肠结肠炎耶尔森菌 利用β-内酰胺酶效应子融合蛋白将效应子转运至宿主细胞

了解细菌中必需过程的功能具有挑战性。利用靶向特异性染料进行荧光显微镜观察，可为微生物细胞生长和细胞周期进程提供关键见解。本文以Agrobacterium...

活细胞荧光显微镜观察微生物细胞生长过程中的关键过程

基于荧光蛋白的方法在监测细菌向宿主细胞分泌效应蛋白时面临挑战，这主要是由于荧光蛋白与III型分泌系统之间存在不兼容性。本文采用一种优化的分裂型超折叠GFP系统，用于可视化细菌向宿主植物细胞中分泌的效应蛋白。...

利用分裂型绿色荧光蛋白系统可视化细菌感染过程中递送的效应蛋白

本文介绍了一种在细胞水平上分析动物组织中细菌基因表达的方法。该方法为研究细菌群体在感染过程中响应组织环境而产生的表型多样性提供了资源。...

一种基于荧光的方法用于研究感染组织中的细菌基因调控

本文提供了使用高分辨率荧光显微镜研究枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus...

活细胞荧光显微镜技术用于研究细菌中亚细胞蛋白定位及细胞形态变化

荧光标记的抗生素是研究抗菌耐药性多个方面的有力工具。本文介绍了荧光标记抗生素的制备方法及其在研究细菌抗生素耐药性中的应用。这些探针可用于通过分光光度法、流式细胞术和显微镜技术研究细菌耐药机制（例如外排作用）。...

利用荧光抗生素探针可视化细菌耐药性

该活细菌细胞成像方案可实现随时间推移在单细胞水平上可视化多种细菌物种之间的相互作用。通过延时成像，可观察每种细菌在单培养或共培养条件下的行为，从而研究多物种细菌群落中的种间相互作用，包括单个细胞的运动性和存活能力。...

单细胞水平细菌种间相互作用的动力学可视化

了解利用活细胞荧光显微镜可视化免疫细胞对链球菌溶血素O毒素响应的方法。该技术通过微注射器局部递送毒素，实时分析细胞动力学变化，揭示炎症小体激活机制，为免疫学研究提供有力工具。

使用活细胞荧光显微镜观察细菌毒素诱导的细胞反应

探索更多视频