细菌毒素引起的响应，用活细胞荧光显微镜的可视化

该程序的目的是可视化免疫细胞对细菌毒素的反应。首先，毒素在 BL 21 金细胞中表达并从中纯化。一旦确认毒素活性和浓度，毒素就会被输送到免疫细胞。

使用显微注射器和高速活细胞显微镜进行。对结果图像的分析揭示了免疫细胞对毒素反应的实时动力学。这种方法可以帮助回答免疫学领域的关键问题，例如炎性小体激活的机制。

虽然这种方法可以提供对毒素介导的免疫细胞反应的见解，但它也可以应用于其他刺激，包括趋化拖拉机。我们在研究细菌与培养的免疫细胞的相互作用并观察到细菌与免疫细胞之间高度可变的相互作用时，首先想到了这种方法。用含有 PAG 3 SLO 的 BL 21 金细胞培养物开始纯化链球菌溶血素 O 或 SLO。

他的质粒生长到大约 0.6 的 OD。为了诱导蛋白质表达，向培养物中加入 5 毫升 20% 的 OSes，并在室温下以 2 25 RPM 摇动 3 小时。接下来，将细菌转移到 500 毫升离心瓶中。

然后在脱水后以 12， 000 倍 G 的 4 摄氏度离心培养物 12 分钟。旋毛将颗粒在零下 80 摄氏度下储存过夜，如果需要，可以储存更长时间。为了纯化表达的 SLO，向冷冻沉淀移液管中加入 10 毫升 ly 洗涤缓冲液，并补充有 Triton X 100 溶菌酶和苯基甲基硫酰氟，上下移液约 15 分钟。

要 Resus，悬浮颗粒，将样品保持在冰上。将重悬的沉淀转移到 50 mL Oak Ridge 圆底聚丙烯管中。使用探针对裂解物进行超声处理，以 40% 输出量超声处理 5 次，每次 30 秒，每次间隔 30 秒，中间在冰上 30 秒。

然后将超声裂解物以 39， 000 倍 G 离心 4 摄氏度 20 分钟。旋转后，将细菌 supinate 加入 1 毫升洗涤镍 NTA aros 中。孵育后，将镍 NTA aros 和裂解物在 4 摄氏度下一起孵育 2.5 小时，轻轻摇晃。

通过在 4 摄氏度下以 400 倍 G 旋转 5 分钟来沉淀珠子。请注意，所有进一步的洗涤和洗脱均使用这些离心设置进行，其他说明较少。离心后。

将 30 微升旋替物与 10 微升四倍 SDS 样品缓冲液混合在微量离心管中，并将其保存在冰上用于纯度分析。然后丢弃剩余的仰卧剂，并在虱子洗涤缓冲液中洗涤珠子四次。一旦在每次洗涤之间进行盐缓冲液离心，从此时开始，请务必始终将样品保持在冰上。

SLO 是一种对氧化还原非常敏感的蛋白质，如果加热到 37 摄氏度，即使时间很短，它也会迅速失去活性。要洗脱 SLO 蛋白，向磁珠中加入 1 mL 洗脱缓冲液和 5 μL 1 mol DTT，在冰上孵育 10 分钟。然后离心并将螺旋体收集在标有 Elucian 编号的离心管中。

重复此过程 3 次，然后耗尽 SLO 蛋白中的内毒素，向样品中加入 200 微升洗涤的聚乙烯混合共轭农业微珠、悬浮的 res 盐缓冲液，并在 4 摄氏度下摇动 30 分钟。然后在 4 摄氏度下以 10， 000 倍 G 旋转 1 分钟。离心后，将上清液收集在新标记的微量离心管中。

将每种洗脱液的 30 μL 与 10 μL（四倍 SDS 样品缓冲液）混合。对于 SDS 页面分析，请将 SLO 解决方案存储在 ice 上。如果满意，测定蛋白质浓度和溶血活性，将 SLOE 拉入 5 到 10 微升季铵盐中，然后在干冰上冷冻并储存在零下 80 摄氏度。

然后确定特异性裂解。里斯。将要测试的细胞悬浮两次。将每毫升的 6 个细胞置于缓冲液 RB 中，浓度为 20 μg/mL。

碘化丙啶。在这里测试 T 27 A 细胞。在单独的微量离心管中，向 96 孔 V 形底板的每个孔中加入 100 微升细胞。

在缓冲液 rb 中连续稀释 SLO 至最终浓度的两倍。然后向细胞中加入 100 微升毒素或 100 微升缓冲液 RB，并在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。典型的最终浓度范围为 2000 单位/毫升至 31.25 单位/毫升。

在流式细胞仪上运行细胞，并使用 fi、cethrin 或 pe 过滤器收集数据。一个对数偏移表示瞬时渗透性细胞，而三个对数偏移表示死细胞。通过在实验板前一天使用此处所示的方程从实验中减去对照中死细胞的百分比来计算细胞的特异性裂解，将五个巨噬细胞两次集中在胶原涂层玻璃上。

底部 35 毫米的培养皿。用于毒素输送的显微镜应配备倒置载物台、加热载物台、适当的激发发射滤光片立方体，以及伯坦透镜（如果有）。该程序最困难的部分是将针头完整地放到细胞中。

为了确保成功，我们使用了 Bertrand 镜头，该镜头通常用于对准，以便在我们将针穿过焦平面时将其可视化。显微镜应连接到微型注射器，并应由具有足够内存的计算机控制以收集和存储数据，打开显微镜和微型注射器，并让加热的载物台时间升温至 37 摄氏度，同时等待载物台加热。用 37 摄氏度的染料标记细胞 30 分钟。

根据测定方法，标记可以用 5 微升、4 或 2：00 AM 在 1 毫升中完成，HBSS 或 2 微升钙在 1 毫升全培养基中，这里使用 4 或 2 微。取出细胞培养基并用 PBS 洗涤细胞一次。吸出 PBS，并用补充有 2 毫摩尔氯化钙的 1 毫升 RPMI 代替。

将培养皿安装在显微镜上，用明场聚焦细胞，然后调整聚焦在细胞略高于细胞上方。接下来，将 1 微升 SLO 毒素、4 微升、每毫升 10 毫克、DEXTRA 5 55 和 6 微升水混合。然后将 20， 000 倍 G 离心 4 摄氏度 10 分钟。

葡聚糖用于验证 femto 尖端没有 G 堵塞。使用微型加载器将两微升稀释的毒素从后部加载到 femto 吸头中。将 femto 吸头装入微量注射器。

然后调整喷油器的角度，使吸头位于单元的中心上方，并有空间向各个方向移动，清除之前的 Z 限制设置，这限制了微量喷油器吸头可以达到的高度。将微型注射器设置为在 120 PSI 和 20 PSI 背压下注射 0.5 秒。然后放下尖端，直到它进入介质。

使用 Bertrand 镜头。将尖端居中并跟随尖端降低，使其更靠近细胞。指针离开焦点后，切换回正常的光学元件。

针影在现场应该很明显。聚焦在细胞上方并降低针头，直到它聚焦。然后将细胞聚焦并小心地将针头靠近细胞。

设置注射的 Z 限值后，开始成像并注射毒素。然后抬起针头并移动到新的细胞区域。注射额外的毒素并在注射后继续成像。

使用本视频中描述的方法，将针头移至原位，以防止任何不需要的毒素从针头中泄漏，每毫升 10 到 7 到 10 到 8 单位。SLO 通常以每毫升 4 毫克的蛋白质浓度获得。该 SDS 页面凝胶显示了纯化后毒素诱导剂前后的细菌样品，三种 ellucians kamasi 蓝染色中的每一种都表明诱导的 SLO 被成功纯化。

SLO 是 69 千道尔顿的条带，用于确定裂解 T 27 A 或 D 两个细胞所需的毒素量。在碘化丙啶存在下，在 37 摄氏度下用不同浓度的 SLO 攻击细胞 5 分钟，并通过流式细胞术检查。特异性裂解测定，如图所示。

每毫升 250 单位。SLO 可裂解 T 27 A 和 D 两个细胞 50%。亚利酸 10% 裂解剂量的毒素为每毫升 62.5 单位。

这些值对于评估毒素暴露后细胞死亡的基准毒素活性很重要。使用 Life Technologies 的 Live Dead 试剂盒将人真皮成纤维细胞与钙和粥样斑块同源二聚体一起孵育。局部暴露于细菌毒素后，人类溶血素 O.In 该图像，钙显示为绿色，粥样斑块显示在靠近微生物组的红色区域，显示以钙丢失和同型二聚体摄取为代表的细胞死亡，而远离尖端的区域则不会显示损伤。

毒素的微递送还允许检查实时事件，例如钙通量。这些加载了 4：02 AM 的人类 dc以恒定流速暴露于 SLO，同时实时成像从绿色变为蓝色。伪色表示胞质钙水平增加。

SLO 诱导胞质钙的快速增加，由于局部递送，钙在培养皿区域传播。然而，只有靠近微量注射器尖端的细胞才会遇到反应器毒素。这证明了细胞对毒素的一种反应和毒素递送的空间限制区域，以解决 zdi 维度中的事件。

微递送与高速 3D 共聚焦显微镜相结合。这组图像显示了毒素注射后的树突状细胞。将它们与偶联的抗 CD 11 C 预孵育，该 PC 偶联为绿色，以标记质膜。

从这里可以看出，毒素输送后会释放微泡。作为细胞修复过程的一部分，毒素分子集中在水泡上，水泡被排出以消除毒素。一旦掌握，显微镜检查可以在 45 分钟内完成。

在尝试此程序时，重要的是要记住在与细胞混合之前保持毒素低温并测试溶血活性。好。观看本视频后，您应该对如何使用活细胞显微镜测量免疫细胞对细菌毒素的反应的实时动力学有了很好的了解。