人类乳腺上皮细胞致癌转化的体外评价

该方法使用不同指标的集成来评估任何细胞模型的转化程度。该技术为研究人员提供了一套耗时但易于使用的工具，用于评估体外细胞转化。这使得该方法可以在大多数实验室中使用。

演示该程序的是我实验室的博士后研究员 Teresa Anglada 和显微镜专家 Joan Repulles。当乳腺原代上皮细胞培养物达到 90% 汇合时，将上清液从培养瓶转移到含有 2 毫升胎牛血清的 15 毫升试管中，并用 PBS 洗涤细胞。在 37 摄氏度下用 1 毫升胰蛋白酶处理细胞 5 分钟。

当细胞分离时，用保留的培养基灭活胰蛋白酶，并通过离心收集细胞。轻弹试管以重悬沉淀，并加入 1 至 2 毫升新鲜培养基进行计数。确定细胞浓度后，将 300， 000 个细胞加入新试管中，并使用额外的新鲜培养基将最终体积增加到 5 mL。

将细胞接种到新的 T25 培养瓶中，并将细胞放回细胞培养箱中。然后使用该公式计算累积总体倍增的数量。为了评估细胞的增殖率，绘制特定时间间隔内群体倍增的累积数量。

斜率增加表示细胞增殖速率增加。要建立 3D 细胞培养物，请用无菌冷 PBS 冲洗表面积为 1.9 平方厘米的孔，并用 100 微升基底膜基质涂覆每个孔的底部。然后将板放入细胞培养箱中约 20 分钟，让基质凝固。

同时，如刚才所示，收获乳腺细胞，并将细胞稀释至每毫升 400， 000 个中等浓度的细胞。将细胞与补充有 8% 基底膜基质的新鲜培养基以一比一的比例混合，并向固化基质的每个孔中加入 500 微升细胞。将细胞在 37 摄氏度下孵育几分钟，然后向每个孔中加入 500 μL 补充有 4% 基底膜基质的培养基。

将细胞置于细胞培养箱中 14 天。接种的细胞将分组并增殖，形成腺泡样结构。对于 3D 培养的乳腺细胞中的免疫荧光蛋白检测，使用截留的 P200 移液器吸头从每个孔中去除基底膜基质，并将每个孔中大约 50 微升的解聚基质涂抹到单个载玻片上。

样品完全干燥后，用零下 20 摄氏度的一对一甲醇-丙酮溶液固定细胞 30 分钟。固定后，用封闭液在室温下封闭样品 2 小时。孵育结束时，加入 30 μL 目标一抗工作溶液，并用一条实验室包装膜覆盖载玻片，以便在 4 摄氏度下在潮湿室中孵育过夜。

第二天早上，用 PBS 洗涤玻片 3 次，每次洗涤 1 小时，并用适当的二抗溶液标记样品，如刚才所示。孵育结束时，在 PBS 中洗涤样品两次，每次洗涤 2 小时，然后用在抗褪色封固剂中稀释的 DAPI 复染，并用盖玻片覆盖每张载玻片。然后在共聚焦显微镜上分析每个 acinus 的荧光信号分布。

要进行不依赖贴壁的测定，首先用 1.5 毫升 0.6% 琼脂的培养基溶液覆盖六孔板适当数量的孔的底部，然后让琼脂在室温下凝固。接下来，如图所示，制备每毫升 5 乘以 10 至 4 个细胞的溶液，并通过 40 微米过滤器将细胞过滤到 50 毫升无菌管中。将试管保持 45 度角，在中等溶液中加入等体积的 0.6% 琼脂，沿试管壁向下添加。

充分混合后，将琼脂悬浮液中的 1 毫升细胞分层到先前制备的六孔板的每个孔中。使用倒置显微镜确认细胞已均匀分散在整个琼脂中。当琼脂完全凝固后，小心地向每个孔中加入 1 毫升刷新培养基，不要干扰琼脂，并将细胞孵育三周，每周更换两次培养基。

在集落形成期结束时，用每孔 1 毫升 1 毫克 MTT 替换培养基，在细胞培养箱中孵育 24 小时。第二天，从每个孔中取出 MTT，并在倒置显微镜上获取每个孔的图像。获取完所有图像后，在 ImageJ 中打开图像，然后单击 image、adjust、threshold 和 apply，通过对原始图像进行阈值处理来获得二进制掩码。

获得分隔良好的菌落后，选择插件和 biovoxxel 以启动扩展颗粒分析仪以识别 MTT 阳性菌落。在特定的时间间隔内，与未转化的细胞相比，部分和完全转化的细胞实现了更多的群体倍增，这表明细胞分裂速率随着转化过程的增加而增加。在为期两周的 3D 细胞培养期间，细胞聚集和增殖，增加了腺泡大小。

使用蛋白质免疫荧光检测结合共聚焦显微镜的三维信号定位，可以准确评估每个 acinus 的正确极化。虽然未转化的乳腺细胞形成的所有腺泡都组织正确，但在部分和完全转化细胞形成的腺泡中观察到极化丢失。包埋琼脂培养 3 周后，具有锚定非依赖性生长能力的细胞产生由多个细胞组成的集落。

只有代谢活跃的细胞才能裂解四唑 MTT 环，在 24 小时后产生紫色的 MTT 甲臜晶体。通过自动图像分析测量菌落直径，可以过滤低增殖菌落或单个细胞。与部分和完全转化细胞形成的菌落数量相比，未转化细胞形成的菌落数量可以忽略

集落大小也可用于区分具有不同转化程度的细胞。这些测定可用于在接种前筛选细胞系，因为只有那些体外检测呈阳性的细胞系才应接种到小鼠中。