Name: 延时成像的主要癌前乳腺上皮细胞来源于遗传工程小鼠乳腺癌模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: 了解延时成像技术用于研究遗传工程小鼠乳腺癌模型中原代癌前乳腺上皮细胞的行为。该方法通过单细胞追踪量化不同基因损伤对细胞动态的影响，为早期癌症机制研究提供重要工具。

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作者感谢吴博凡和Christian Raithel提供的技术支持，以及Michael Rieger对活细胞成像技术的指导。本研究得到以下资助：美国国家癌症研究所（NCI）、美国国立卫生研究院（NIH）RO1CA112176（P.A.F.），美国国家癌症研究所（NCI）、美国国立卫生研究院（NIH）R01CA89041-10S1（P.A.F.），德国学术交流中心（Deutscher Akademischer Austaush Dienst e.V.）A/09/72227 号项目（编号316，R.E.N.），美国国防部资助项目W81XWH-11-1-0074（R.E.N.），韩国教育科技部通过国家研究基金会资助的世界一流大学（WCU）项目（R31-10069）（P.A.F.），美国国立卫生研究院（NIH）IG20 RR025828-01（啮齿类屏障设施设备），以及美国国立卫生研究院国家癌症研究所（NIH NCI）5P30CA051008（显微成像与动物共享资源）。

1. 总体方案
<ol>
	<li>从基因工程小鼠和对照野生型小鼠的乳腺组织中建立癌前乳腺上皮细胞的原代培养体系。</li>
	<li>使用 Volocity 图像采集软件（版本 5.3.1，PerkinElmer，Waltham，MA）每 15 分钟采集一次活细胞图像，持续最长 5 天。</li>
	<li>直接观察延时图像，评估上皮细胞克隆形成的时序与机制、凋亡发生率以及形态学变化的阶段特征。</li>
	<li>使用 MetaMorph 显微镜自动化与图像分析软件（Molecular Devices, LLC，Sunnyvale，CA）将 Volocity 生成的 .TIFF 图像序列转换为 .JPG 文件，并使用 THE Rename 软件（版本 2.1.6，<a href="http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml" target="_blank">http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml</a>）重命名数字图像文件，以适配 Timm's Tracking Tool 软件（TTT，<a href="http://www.helmholtz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index.html" target="_blank">http://www.helmholtz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index.html</a>）的使用要求。</li>
	<li>利用 TTT 软件生成细胞命运图谱，用于确定细胞分裂间隔时间（细胞寿命）以及细胞分裂模式（对称性与非对称性分裂）。</li>
	<li>对上述第 3 步和第 5 步获得的定量数据进行分析，判断不同基因工程小鼠模型之间以及与野生型对照组之间是否存在统计学上的显著差异。</li>
</ol>
2. 原代乳腺上皮细胞培养物的制备
<ol>
	<li>根据生产商说明书的改良方法制备用于分离单个乳腺上皮细胞的完全培养基（EpiCult-B 小鼠培养基试剂盒，Stemcell Technologies，加拿大温哥华）。将 450 ml Epi-Cult-B 培养基、50 ml Epi-Cult B 增殖补充剂、5% 胎牛血清（FBS）、50 μg/ml 青霉素/链霉素（PenStrep）和 10 ng/ml 表皮生长因子（EGF）混合均匀。</li>
	<li>将 1 份 10 倍浓度的胶原酶/透明质酸酶混合液与 9 份来自步骤 2.1 的完全培养基混合，制备解离培养基。</li>
	<li>处死小鼠并立即进行解剖。将小鼠仰卧于泡沫解剖板上，固定四肢使腹部皮肤绷紧。用 70% 乙醇充分浸润腹部皮肤及毛发，包括四肢覆盖区域。通过沿腹中线切开皮肤（勿进入腹膜腔），并分别向前肢内侧皮肤延伸为 Y 形切口、向后肢内侧皮肤延伸为倒 Y 形切口，暴露第 2/3 对（胸部）和第 4/5 对（腹股沟）乳腺组织。</li>
	<li>使用钝性解剖法将皮肤与下方腹膜分离，向两侧拉紧皮肤并用图钉固定于泡沫解剖板上。从外侧开始，谨慎使用解剖剪进行钝性分离，将完整的腹股沟和/或胸部乳腺组织从下方结缔组织和肌肉中游离出来。每 10 cm 无菌培养皿中放置不超过两个乳腺组织，并转移至组织培养超净台。</li>
	<li>在组织培养超净台内，检查乳腺组织中是否存在呈淡黄色、边界清晰的小结节状乳腺淋巴结。使用无菌手术刀和镊子将其从周围腺体组织中去除。用两把无菌手术刀（每手一把）将乳腺组织切成约 1 mm3 的小块。</li>
	<li>将切碎的乳腺组织放入 5 ml 解离培养基中，用 10 ml 移液器轻柔吹打 2–3 次混匀，然后转移至 50 ml 锥形管（盖子松开）中，在 37 °C、5% CO2 条件下过夜孵育（最长约 16 小时）。</li>
	<li>次日早晨，配制低温的红细胞裂解液：将 1 份含 2% FBS 的 Hanks 平衡盐溶液（HBSS）与 4 份缓冲的氯化铵溶液混合（HFAmCl）；同时准备补充 2% FBS 的低温 HBSS（HF）。预热胰蛋白酶-EDTA（0.25%）、5 mg/ml Dispase 溶于改良 Hank's 平衡盐溶液、1 mg/ml DNase I 以及完全培养基。</li>
	<li>从培养箱中取出含有乳腺组织的锥形离心管，轻柔脉冲式涡旋振荡 2–3 秒，重复两次。以 450 × g 离心 5 分钟（室温或 4 °C），弃去上清液。</li>
	<li>将沉淀物重悬于至少 10 ml HFAmCl 中，以 450 × g 离心 5 分钟（室温或 4 °C），弃去上清液。</li>
	<li>向沉淀物中加入 3 ml 胰蛋白酶-EDTA，先用 5 ml 移液器混匀，再用 P1000 移液器吹打至出现丝状物（1–3 分钟）。加入 10 ml HF，以 450 × g 离心 5 分钟（室温或 4 °C），弃去上清液。</li>
	<li>向沉淀物中加入 2 ml 5 mg/ml Dispase 和 200 μl 1 mg/ml DNase I，用 P1000 移液器混匀 1 分钟。样品应呈浑浊状但无丝状物。若仍有丝状物，再加入 100 μl DNase I 并再次混匀。</li>
	<li>加入 10 ml 冷 HF，经 40 μm 细胞滤网过滤后，以 450 × g 离心 5 分钟（室温或 4 °C），弃去上清液。</li>
	<li>将最终沉淀物重悬于完全培养基中。定量总细胞数（使用血细胞计数板或库尔特计数器）。两个乳腺组织可获得约 1 × 106 至 1 × 107 个细胞。将原代上皮细胞以每孔 1.5 × 105 个细胞的密度接种于平底 6 孔板中。</li>
</ol>
3. 活细胞成像
<ol>
	<li>细胞铺板后，立即将6孔板稳妥地放置在配备5% CO2、饱和湿度和37 °C恒温培养环境的显微镜载物台上。调节聚光镜以实现科勒照明，并对中相差环。本实验采用尼康Eclipse TE300/PerkinElmer旋转盘共聚焦显微镜系统，在明场相差模式下使用10倍物镜进行成像。</li>
	<li>打开图像采集软件，创建并命名用于存储延时图像的库，并保存至具有足够存储空间的位置。本实验使用Volocity图像采集软件（版本5.3.1，PerkinElmer，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。</li>
	<li>让6孔板在显微镜培养箱中至少平衡15分钟。降低物镜以避免载物台与物镜发生碰撞。在“Stage”（载物台）选项下选择“Calibrate Stage”（校准载物台）。重新获取焦平面，在x、y、z选项卡中将Z轴设为零，并在“Stage”下选择“Add point”（添加点）以标记成像位点。为避免塑料孔边缘区域相差成像发生畸变，应将每个孔的成像点置于孔中央。将各点按4×4区域（每个区域650 μm × 700 μm）排列成方形，相邻区域间保留约5%的微小重叠。在“Stage”中保存所选位点。</li>
	<li>在“Stage”中选择“Make focus map”（生成焦面图），并根据提示设置每个位点的焦平面。设定图像采集时间为每小时拍摄4张图像（即每15分钟一次）。可根据具体实验需求调整采集频率。在“Stage”中保存生成的焦面图。</li>
	<li>右键单击右侧工具栏中的“Image Acquisition”（图像采集）并保存成像设置。点击录制按钮开始成像。1小时后检查图像焦点，确认是否需要调整。</li>
	<li>持续监测并进行活细胞成像，共持续5天，直至细胞达到完全汇合时结束。</li>
</ol>
4. 直接观察延时图像以评估初始上皮细胞克隆形成的时序与机制、凋亡发生率以及形态学变化的时相
<ol>
	<li>可使用任何兼容的视频查看软件（例如 <a href="http://www.real.com/" target="_blank">http://www.real.com/</a>RealPlayer 或其他免费或商业软件）直接查看延时图像。在此步骤中，图像可直接以 .TIFF 格式查看，或在转换为 .JPG 文件后查看（见步骤 5）。</li>
	<li>为确定初始克隆形成的机制，需从代表培养板上某一成像位点的单幅图像序列开始。在初始帧中，细胞处于悬浮状态。通过连续图像追踪，确定首个上皮细胞何时黏附至培养板。在此阶段，可通过其更接近立方体的形态，将上皮细胞与成纤维细胞进行识别和区分。持续追踪该单个上皮细胞在后续 24 小时内的连续图像，记录其命运变化：是否被其他上皮细胞包围，或发生细胞分裂，或发生凋亡。若被上皮细胞包围，可通过观察周围细胞的来源直接判断克隆形成机制：这些细胞是来自悬浮细胞随后聚集到初始黏附细胞（或细胞群）周围，还是由初始黏附细胞分裂产生。记录在最初 24 小时内通过细胞聚集与细胞分裂分别形成的克隆数量。</li>
	<li>为确定在特定时间段内发生凋亡的初始黏附细胞数量，需追踪连续图像，观察已黏附细胞是否出现典型的凋亡特征（<a href="http://www.alsa.org/research/about-als-research/cell-death-and-apoptosis.html" target="_blank">http://www.alsa.org/research/about-als-research/cell-death-and-apoptosis.html</a>），并记录在整个成像期间或特定时间窗口内识别出的凋亡细胞数量。</li>
	<li>随着时间推移，培养中的上皮细胞形态会从初始的立方体状逐渐转变为更细长的形态，符合上皮-间质转化（EMT）的特征。通过追踪连续图像，确定接种后发生此形态变化的具体天数/小时。</li>
</ol>
5. 图像文件修改
<ol>
	<li>通过 Volocity 软件将图像文件导出为 TIFF 图像序列。此处使用 MetaMorph 显微成像自动化软件 &amp; 使用图像分析软件（Molecular Devices, LLC，Sunnyvale, CA）打开TIFF堆栈文件，然后将其以单个.JPG图像格式保存在MetaMorph中。</li>
	<li>根据Timm's Tracking Tool软件的要求重命名图像文件夹和文件<a href="http://www.helmholtz-muenchen.de/fileadmin/ISF/PDF/Haematopoese/publications/TTT_Operating_Instructions_July_2009_.pdf" target="_blank">http://www.helmholtz-muenchen.de/fileadmin/ISF/PDF/Haematopoese/publications/TTT_Operating_Instructions_July_2009_.pdf</a>）。使用类似 THE Rename 2.1.6 的免费软件（<a href="http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml" target="_blank">http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml</a>) 以批量重命名文件。创建一个包含该实验所有文件夹和文件的文件夹，并将该文件夹命名为（例如 实验名称</li>
	<li>为每次成像的位点/位置创建一个子文件夹。将子文件夹命名为：EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER，其中位点编号应为三位数字。示例：072511RN_p001。将该位点的所有图像文件放入对应的子文件夹中。</li>
	<li>在每个文件名的末尾以如下格式添加时间点（使用5位数字）和通道编号（由于仅有一个明场通道，使用“0”）： 
	EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER_tTIMEPOINT_wCHANNELNUMBER.jpg 示例：072511RN_p001_t00001_w0.jpg</li>
	<li>从TTT网站下载免费程序TTTlogfileconverter，然后为每个位置生成日志文件。启动TTTlogfileconverter程序并选择实验文件夹。输入图像时间间隔（单位为秒）。若每15分钟拍摄一张图片，则输入900秒。然后按下绿色的“转换日志文件”按钮。</li>
</ol>
6. 使用 TTT 生成单细胞命运图谱
<ol>
	<li>创建一个名为 TTTexport 的文件夹，并在其内创建一个名为 TTTfiles 的子文件夹，用于按照 TTT 软件说明（<a href="http://www.helmholtz-muenchen.de/fileadmin/ISF/PDF/Haematopoese/publications/TTT_Operating_Instructions_July_2009_.pdf" target="_blank">http://www.helmholtz-muenchen.de/fileadmin/ISF/PDF/Haematopoese/publications/TTT_Operating_Instructions_July_2009_.pdf</a>）存储所有细胞追踪数据。</li>
	<li>启动 TTT 程序，选择用户姓名缩写，然后点击“Continue”（继续）。</li>
	<li>点击“Set NAS”，选择用户创建的“TTTexport”文件夹，然后点击“Ok”（确定）。在浏览器中选择一个实验文件夹，再选择一个位置文件夹，然后点击“Load position”（加载位置）按钮。</li>
	<li>将目镜倍率因子设置为“10x”。加载所需数量的图像（首次操作建议加载全部图像）。</li>
	<li>在细胞编辑器窗口中，从“File”（文件）菜单下选择“New colony”（新建克隆）。在“Movie”（视频）窗口中按下“Track cell”（追踪细胞）按钮或按 F2 键，开始追踪一个细胞。</li>
	<li>在“Movie”窗口中识别一个细胞，并用鼠标将光标置于该细胞上。按下 F2 后，应出现一个带有细胞编号的圆圈。使用键盘数字小键盘上的“0”键追踪细胞位置并进入下一幅图像。移动光标以在每一帧中跟随细胞的位置变化。如需删除当前轨迹并返回上一图像，请按数字小键盘上的“Del”（删除）键；如需在不追踪细胞的情况下向前翻帧，请按“3”键；如需向后翻帧，请按“1”键。</li>
	<li>如需标记细胞分裂，请点击“Movie”窗口中的“Division”（分裂）按钮；如需标记细胞死亡，请点击“Movie”窗口中的“Cell death”（细胞死亡）按钮。发生分裂后，可在细胞编辑器窗口中通过右键点击指定子代细胞的圆形符号，自动进入追踪模式，从而在同一细胞命运图中继续追踪子代细胞。</li>
	<li>按 F10 键保存谱系树。每棵谱系树将保存至指定的输出文件夹（TTTExport）。如需开始新的细胞命运图，请在细胞编辑器窗口的“File”（文件）菜单下选择“New colony”（新建克隆），然后选择“Open”（打开）。</li>
	<li>从细胞编辑器窗口的“Cell data”（细胞数据）选项卡中收集数据后，整理细胞寿命信息。</li>
</ol>
7. 统计分析
<ol>
	<li>使用学生t检验（若比较两种基因型）或方差分析（ANOVA）（若比较 &gt; 两种基因型）以确定不同基因型之间在参数数据（如初始细胞克隆数量、细胞寿命或上皮-间质转化出现前的小时数）上的差异是否具有统计学显著性。凋亡频率可表示为贴壁细胞百分比，采用 Student t 检验或 ANOVA 进行比较，或使用 Mann-Whitney 检验或 Kruskal-Wallis 检验进行分析。</li>
	<li>使用初始实验分析数据，通过可用的免费软件进行功效检验，以确定为获得足够的统计功效，需要进行多少次实验重复，以及每次重复需生成多少细胞命运图谱例如 <a href="http://statpages.org/" target="_blank">http://statpages.org/</a>在本研究所展示的实验中，每种基因型使用三只小鼠来源的细胞培养物，足以确定在进行特定基因修饰后，细胞克隆形成能力与细胞寿命是否存在统计学显著差异。</li>
</ol>

<ol><li>Jones, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+estrogen+signaling+pathways+collaborates+with+loss+of+Brca1+to+promote+development+of+ERalpha-negative+and+ERalpha-positive+mammary+preneoplasia+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Activation of estrogen signaling pathways collaborates with loss of Brca1 to promote development of ERalpha-negative and ERalpha-positive mammary preneoplasia and cancer.</a> Oncogene. 27, 794-802 (2008).</li>
<li>Burga, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+proliferation+and+differentiation+properties+of+primary+mammary+epithelial+cells+from+BRCA1+mutation+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Altered proliferation and differentiation properties of primary mammary epithelial cells from BRCA1 mutation carriers.</a> Cancer Res. 69, 1273-1278 (2009).</li>
<li>Li, M., Wagner, K., Furth, P. A. Preparation of primary mammary epithelial cells and transfection by viral and nonviral methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLi%2C+M+%22Methods+in+Mammary+Gland+Biology+and+Breast+Cancer%22">Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer</a>. Ip, M., Asch, B. , Kluwer Academic, Plenum Press. (2000).</li>
<li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+stem-cell-driven+regeneration+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals.</a> Nature. 453, 345-351 (2008).</li>
<li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+single-cell+imaging+of+mammalian+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Long-term single-cell imaging of mammalian stem cells.</a> Nature Methods. 8, S30-S35 (2011).</li>
<li>Eilken, H. M., Nishikawa, S. -I., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+single-cell+imaging+of+blood+generation+from+haemogenic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Continuous single-cell imaging of blood generation from haemogenic endothelium.</a> Nature. 457, 896-900 (2009).</li>
<li>Kokkaliaris, K. D., Loeffler, D., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+tracking+hematopoiesis+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+hematology%22%5BJournal%5D)">Advances in tracking hematopoiesis at the single-cell level.</a> Current opinion in hematology. , (2012).</li>
<li>Rieger, M. A., Hoppe, P. S., Smejkal, B. M., Eitelhuber, A. C., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+cytokines+can+instruct+lineage+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic cytokines can instruct lineage choice.</a> Science. 325, 217-218 (2009).</li>
<li>Rieger, M. A., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instruction+of+lineage+choice+by+hematopoietic+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Instruction of lineage choice by hematopoietic cytokines.</a> Cell Cycle. 8, 4019-4020 (2009).</li>
<li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nat. Protoc. 6, 214-228 (2011).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

关键步骤
为控制年龄相关因素对乳腺上皮细胞行为的影响，必须确保从小鼠中采集乳腺组织时使用相同年龄的小鼠。在接种细胞时，每次实验的每个孔中应接种相同数量的细胞。接种时细胞密度应相对较低，以避免培养物过快达到汇合状态，从而能够通过连续成像追踪多个单个细胞。在成像前，必须将培养板在培养箱中充分平衡，因为培养板平衡后焦点会发生变化。一旦开始成像，应频繁检查并根据需要调整焦点，尤其是在前24小时内。培养箱的温度必须精确调控并预先预热。应尽可能减少进出房间的人员数量。我们建议在正式实验前预先练习实验设置的各个环节，以确保实验的可重复性和质量控制。与所有细胞培养实验一样，无菌操作至关重要，必须始终遵循标准的无菌细胞培养操作规范。
保存和处理大型图像文件需要大量的存储空间。可以使用共享网络驱动器或便携式硬盘。文件转换完成后，务必确保图像文件被正确且一致地命名，并存放在相应的文件夹中。在整个过程中，应频繁保存数字数据。
局限性
该方法采用二维培养...

转基因小鼠模型是用于研究和理解不同遗传损伤如何影响乳腺癌发病风险的工具。例如，转基因小鼠研究表明，三个因素的共同作用：乳腺癌1号基因全长缺失（Brca1）在乳腺上皮细胞中的缺失、肿瘤蛋白p53（Tp53）生殖系单倍体不足，以及乳腺上皮细胞靶向上调雌激素受体α（ERa）的表达，可导致100%的Brca1floxed (f)11/f11/小鼠乳腺肿瘤病毒 (MMTV)-Cre/p53+/-/四环素操纵子 (tet-op)-ER/小鼠乳腺肿瘤病毒-反向四环素转录激活因子 (rtTA小鼠在12月龄前发生乳腺癌，相比之下，Brca1f11/f11/MMTV-Cre/p53+/-小鼠未过表达ERa时的发病率较低（约50–60%），而Brca1f11/f11/MMTV-Cre小鼠在无Tp53单倍体不足的情况下发病率则更低（&lt;5%）1。
对癌前体乳腺上皮细胞行为进行动态延时成像，可揭示在静态组织切片中较难察觉的细胞行为差异。在携带人类BRCA1基因突变的个体来源的原代乳腺细胞中，可观察到增殖与分化方面的改变。2 通过酶解法解离切除的乳腺组织，可从正常小鼠及基因工程小鼠中制备原代乳腺上皮细胞的单细胞悬液。3 借助延时图像分析，可评估细胞克隆出现的机制与时间进程，以及细胞形态学变化的发生情况，包括上皮-间质转化（EMT）和细胞凋亡。利用单细胞追踪技术，可生成细胞命运图谱，量化细胞分裂间隔时间（细胞寿命），并确定细胞分裂模式。Timm's追踪工具（TTT）是一款公开可用的软件，用于生成单细胞命运图谱。该工具在阐明细胞命运机制方面的有效性已被证实4,5，并已应用于正常造血干细胞发育6-9及神经元生成的研究10。

<table><tbody><tr><td>EpiCult-B 培养基 小鼠</td><td>StemCell Technologies</td><td>05610</td><td></td></tr><tr><td>EpiCult-B 增殖添加剂 小鼠</td><td>StemCell Technologies</td><td>05612</td><td></td></tr><tr><td>重组人表皮生长因子（rhEGF）</td><td>StemCell Technologies</td><td>02633</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶/透明质酸酶</td><td>StemCell Technologies</td><td>07912</td><td></td></tr><tr><td>一次性解剖刀片</td><td>Feather</td><td>2975#10</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' 平衡盐溶液</td><td>StemCell Technologies</td><td>37150</td><td></td></tr><tr><td>氯化铵</td><td>StemCell Technologies</td><td>07800</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>StemCell Technologies</td><td>07901</td><td></td></tr><tr><td>中性蛋白酶</td><td>StemCell Technologies</td><td>07913</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>StemCell Technologies</td><td>07900</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;m 细胞滤器</td><td>StemCell Technologies</td><td>27305</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>StemCell Technologies</td><td>06100</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr></tbody></table>

乳腺癌基因工程小鼠模型来源的原发性癌前乳腺上皮细胞的延时成像

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

活细胞成像可用于比较源自不同遗传工程小鼠乳腺癌模型的原代癌前乳腺上皮细胞在培养中的行为差异。例如，可对携带特定基因突变的细胞进行量化和比较，包括细胞分裂间隔时间（细胞寿命）、凋亡细胞数量、形态学变化的演变过程以及集落形成机制。原代乳腺上皮细胞培养物来源于未触及肿瘤的乳腺组织。手术时需仔细分离乳腺组织，避免邻近肌肉组织混入，去除淋巴结后，通过切碎乳腺组织并经酶解离和过滤，获得富集的乳腺上皮单细胞悬液。将单细胞悬液接种后，立即置于培养箱内的显微镜下进行活细胞成像。在6孔板的每个孔中，以4×4阵列选取16个650 μm × 700 μm的视野，每15分钟拍摄一次，持续5天。通过直接观察延时图像，可测量细胞行为，包括细胞接种后最初24小时内集落形成的机制与频率（细胞聚集或细胞增殖）、凋亡发生率以及形态学变化的时相特征。采用单细胞追踪技术生成细胞命运图谱，用于测定单个细胞的寿命并分析细胞分裂模式。定量数据通过统计学方法分析，以评估不同基因突变所导致的细胞行为差异是否具有显著性。

上皮细胞和成纤维细胞可通过细胞形态进行区分。上皮细胞呈立方状（图1A-B），并形成细胞集落（图1A）。成纤维细胞是一种间质细胞，具有细长的形态（图1C）。
成像开始时，细胞呈圆形并悬浮生长（图 2A-D）。贴壁后，细胞变扁平，呈现立方样形态（图 2E, H）。培养至第4天时，大多数上皮细胞伸长，呈现出类似上皮-间质转化（EMT）的形态（图 2I-L）。这种变化在所有研究的基因型中均以相同的时间进程发生。部分数字图像模糊，原因是科勒照明和相差环未正确调节（图 2D, H, L）。
接种后24小时，悬浮细胞形成了明确的单个上皮细胞克隆（图3A，B）。连续图像分析显示，这些克隆是通过细胞聚集而非细胞分裂形成的。单独破坏Brca1基因并不影响形成...

采用延时成像技术来评估源自乳腺癌风险转基因小鼠模型的原发性癌前乳腺上皮细胞的行为，以确定特定行为参数与不同基因损伤之间是否存在相关性。

延时成像可用于比较源自不同遗传背景的原代癌前乳腺上皮细胞在培养中的行为差异。

以下实验的总体目标是确定易感乳腺癌的遗传损伤是否会改变原代培养中乳腺可塑性记忆细胞的行为。为此，首先从基因工程小鼠中分离原代乳腺上皮细胞。第二步，进行为期五至七天的活细胞延时成像，生成一段用于分析细胞行为的动态影像。然后利用一种能够追踪单个细胞的软件程序，对从不同基因工程小鼠乳腺癌模型中分离出的细胞行为进行定量和比较。结果表明，特定的基因损伤会在癌前记忆中诱导出不同的细胞行为。这些结论基于通过单细胞追踪技术进行的定量行为分析得出的上皮细胞数据。尽管该方法可揭示不同基因损伤如何改变癌前乳腺上皮细胞的行为，但它也可应用于其他系统，例如其他器官的癌前细胞、来自任何器官的癌细胞，包括研究可能的治疗诱导行为变化，以及比较正常和癌变组织中基质细胞的行为以展示该操作流程。今天演示的是本论文的通讯作者普里西拉·菲尔思博士（Dr. Priscilla Firth）以及乔治城大学伦巴第癌症研究中心显微成像共享资源中心经理皮特·约翰逊（Pete Johnson）。处死一只小鼠后立即进行解剖。将小鼠仰卧置于泡沫塑料解剖台上，固定四肢，使腹部皮肤绷紧。用70%乙醇浸湿腹部皮肤和毛发，包括四肢的皮肤。通过皮肤正中切口暴露第二、第三以及第四、第五对乳腺。通过四肢内侧皮肤做两个Y形切口以延长切口。使用钝性分离时注意不要进入腹膜腔。将皮肤与下方的腹膜分离。向两侧拉开皮肤，直至绷紧，然后从外侧开始将其固定在平台上。使用剪刀进行钝性解剖，将完整的腹股沟和胸部乳腺组织与下方的结缔组织及肌肉分离。将一至两个乳腺组织放入直径10厘米的培养皿中，并转移至组织培养超净台。随后，检查乳腺组织中是否存在乳腺淋巴结。淋巴结呈小而边界清晰的结节状，颜色微黄。使用手术刀和镊子将组织从周围腺体中分离。用两把手术刀将乳腺组织切成毫米大小的碎块。将切碎的乳腺组织放入含有5毫升解离液的50毫升锥形管中。轻轻混匀后过夜孵育。次日保持瓶盖松开。分离并培养原代上皮细胞。接种细胞后立即进行。将六孔板牢固地放置在带有孵育室的显微镜载物台上。让培养板至少平衡15分钟。调节聚光镜以获得科勒照明，并将相差环居中。打开图像采集软件（如 Velocity），为延时图像创建并命名一个库，并保存到具有足够空间存储大文件的位置。降低物镜，以避免物镜与载物台发生干涉。在载物台标题下，选择校准载物台以重新获取焦平面，并在 X、Y、Z 选项卡下将 Z 设为零。通过在载物台下选择“添加点”来标记成像点，并将成像点放置在每个孔的中央。在塑料孔板边缘附近，相差成像可能会发生畸变。将各点以四乘四的视野排列成方形，每个视野之间重叠约5%。将选定的点保存在载物台上。在载物台界面中选择“创建焦距图”，并根据提示设置每个点的焦距。然后设置图像采集时间，以确保每小时捕获适当数量的图像。现在将焦距图保存在载物台下。在右侧工具栏中右键单击图像采集选项，然后保存成像设置。一小时后按下录制按钮以开始成像过程，并检查图像的焦点，以确定是否需要进行调整。当细胞达到融合状态后，持续进行为期五天的活细胞成像。在最初24小时内，必须密切监控所获取的数字图像，并频繁调整焦平面图，因为此后细胞会逐渐贴壁，需至少每天观察两次。需确认细胞处于清晰对焦状态，且培养物无污染。为了确定初始菌落形成的机制，首先获取代表培养板上一个成像位点的单个图像序列。在初始帧中，细胞处于悬浮状态，可通过细胞形态区分上皮细胞和成纤维细胞。上皮细胞呈立方体状，并形成细胞菌落。成纤维细胞是一种间质细胞，具有细长的形态。通过连续观察图像，确定首个上皮细胞何时黏附到培养板上。在此步骤中，可通过上皮细胞更接近立方形的形态，将其与成纤维细胞区分开来。通过连续图像追踪该单个上皮细胞，并观察其在随后24小时内的命运。记录该细胞是否被其他上皮细胞包围、发生细胞分裂或经历凋亡。若该细胞被上皮细胞包围，则可据此判断克隆形成机制是源于周围细胞的聚集，还是源于细胞分裂。记录在最初24小时内通过细胞聚集与细胞分裂形成的克隆数量，以确定在特定时间段内发生凋亡的初始贴壁细胞数量。根据随时间推移贴壁细胞中凋亡典型特征出现的连续图像进行观察。培养中的上皮细胞形态由最初的立方形逐渐转变为更长的梭形，符合上皮-间质转化（EMT）的表现。根据连续拍摄的图像确定接种后的天数和小时数。当达到相应时间点时，开始启动TTT程序。选择用户姓名缩写，然后点击继续。按下设置NAS，选择用户创建的TTT导出文件夹，然后点击确定。在浏览器中，选择一个实验文件夹。选择一个位置文件夹，然后按下加载位置按钮。将目镜倍率调整至10倍。加载所需的图像数量，通常为全部图像。首次使用此分析时，在电影窗口的文件菜单中，于细胞编辑器窗口内选择“新建克隆”。按下跟踪细胞按钮或按 F2 键以开始跟踪细胞。在视频窗口中识别一个细胞，并将光标置于该细胞上方。单击 F two 后，应出现一个带有细胞编号的圆圈。使用数字小键盘上的零键来追踪细胞的位置，并进入下一张图片。移动光标，跟随每个细胞在每一帧中的位置变化。要删除轨迹并返回上一帧图像，请按数字小键盘上的删除键，按“3”可在不追踪细胞的情况下向前移动帧，按“1”可在不追踪的情况下向后移动帧。要在视频窗口中标记细胞分裂，请点击“分裂”按钮；要在视频窗口中标记细胞死亡，请点击“细胞死亡”。一旦发生分裂，子细胞可以在同一细胞命运图中进行追踪。为此，请进入细胞编辑窗口，右键单击指定的子细胞的圆形符号。这将自动启动追踪模式，然后按 F10 保存谱系树。每棵树将保存在指定的输出文件夹中。要在细胞编辑器窗口中新建硫酸盐图谱，请选择打开菜单，点击文件，然后点击。新形成的菌落细胞在成像开始时呈圆形且悬浮状态。比例尺为 200 微米。细胞贴壁后变扁平，呈立方样形态。培养至第 4 天时，大多数上皮细胞伸长，呈现出类似上皮-间质转化（EMT）的形态。这种变化在所有研究的基因型中均以相同的时间进程发生，悬浮细胞发育为明确的单个上皮细胞克隆。接种后24小时，连续图像分析显示，这些克隆是由细胞聚集形成，而非细胞分裂产生。虽然单独破坏BRCA1本身并不改变形成的克隆数量，但加入TP53单倍体不足后，显著减少了形成的克隆数量。同样，通过该操作流程，ERα的过表达显著增加了形成的克隆数量。此外，还可采用延时成像结合单细胞追踪的技术，以回答其他问题，例如特定治疗策略或额外的遗传损伤如何改变细胞行为，并可能影响治疗反应或癌症进展。

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乳腺癌基因工程小鼠模型来源的原发性癌前乳腺上皮细胞的延时成像

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