延时成像的主要癌前乳腺上皮细胞来源于遗传工程小鼠乳腺癌模型

以下实验的总体目标是确定易患乳腺癌的遗传病变是否会改变原代培养中松果体塑料记忆细胞的行为。这是通过从基因工程小鼠中分离原代乳腺上皮细胞来实现的。作为第二步，在 5 到 7 天内进行活细胞延时成像，制作视频来分析细胞行为。

然后，使用跟踪单细胞的软件程序来量化和比较从不同基因工程乳腺癌小鼠模型中分离的细胞的行为。结果表明，特定的遗传病变在肿瘤前记忆中诱导不同的行为。基于使用单细胞追踪进行的定量行为分析的上皮细胞。

尽管这种方法可以深入了解不同的遗传损伤如何改变肿瘤前乳房上皮细胞的行为。它也可以应用于其他系统，例如癌前体、来自其他器官的细胞、来自任何器官的癌细胞，包括对可能的治疗诱导的行为变化的研究，以及来自正常组织和癌组织的基质细胞行为的比较来证明该程序。今天将邀请本出版物的资深作者 Priscilla Firth 博士和乔治城大学 Lombardi 癌症研究中心显微镜和成像共享资源中心经理 Pete Johnson。

对小鼠实施安乐死，并立即进行尸检。将小鼠仰卧放在聚苯乙烯泡沫塑料尸检平台上，并固定所有四个肢体，使腹侧皮肤绷紧。用 70% 乙醇浸透腹侧皮肤和毛发，包括四肢上的皮肤。

暴露 2 号和 3 号以及 4 号和 5 号乳腺，并在皮肤上有一个中线切口。用两个 y 切口穿过四个肢体的内侧皮肤延伸切口。小心不要使用钝性解剖进入腹膜。

将皮肤与下面的腹膜分开。向后拉皮肤的两侧，直到它绷紧，然后从外侧开始将其固定在平台上。使用剪刀进行钝性解剖，将完整的和/或胸部乳腺与下面的结缔组织和肌肉分离。

将一个或两个乳腺放入 10 厘米培养皿中，然后移至组织培养罩中。现在，检查腺体中的乳腺淋巴结。小的、界限清楚的结节，呈淡黄色。

使用手术刀和镊子将它们从周围的腺体中取出。用两把手术刀将乳腺组织切成毫米大小的方块。将切碎的乳腺组织放入装有 5 毫升解离培养基的 50 毫升锥形管中。

将其与温和的溶液混合并孵育过夜。第二天保持瓶盖松散。分离和培养原代上皮细胞。

铺板细胞后立即。将六孔板牢固地放置在孵育室内的显微镜载物台上。让板平衡至少 15 分钟。

调整聚光镜以获得 Kohler 照明并使相位环居中。打开图像采集软件（如 Velocity ），为延时图像创建并命名一个库，并保存到具有足够空间放置大文件的位置。降低镜头以避免舞台镜头干扰。

在舞台标题下，选择 X、Y、Z 选项卡下的校准舞台重新获取焦平面集 Z 等于零。并通过选择舞台下的添加点来标记成像点。Heading 将成像点放在每个孔的中间。

相差成像可能在塑料孔外围附近发生扭曲。将正方形中的点排列为 4 x 4 个字段，每个字段的重叠率约为 5%。将所选点保存在 stage 下。

在 stage （阶段） 下，选择 make focus map （制作焦点图） 并按照提示设置每个点的焦点。然后设置图像采集时间，使其每小时捕获正确数量的图片。现在，将焦点映射保存在 stage 下。

右键单击右侧工具栏上的图像采集继续。然后保存映像设置。一小时后按下录制按钮开始成像过程，检查图像的焦点以查看是否需要任何调整。

当细胞汇合时，监测并继续实时成像 5 天。在最初的 24 小时内，监测采集的数字图像并频繁调整聚焦图至关重要，因为此后细胞将每天至少两次附着在板上。检查细胞是否聚焦且培养物未被污染。

要确定初始集落形成的机制，请从代表板上一个成像位点的单个图像堆栈开始。在初始帧中，细胞将是浮动的，上皮细胞和成纤维细胞可以通过细胞形态来区分。上皮细胞呈长方体形状并形成细胞集落。

成纤维细胞是一种基质细胞，具有细长的形态。按照连续图像确定第一个上皮细胞何时粘附在板上。在此步骤中，可以通过其更立方体的形态来识别上皮细胞并将其与成纤维细胞区分开来。

通过连续图像跟踪这个单个上皮细胞，并跟踪其在随后 24 小时内的命运。请注意，如果细胞被额外的上皮细胞包围，发生细胞分裂或发生细胞凋亡如果被上皮细胞包围，则可以根据周围细胞的聚集或细胞分裂来确定集落形成的机制。记录前 24 小时内由细胞聚集与细胞分裂形成的集落数，以确定在特定时间段内发生细胞凋亡的初始贴壁细胞数。

按照系列图像，了解随着时间的推移粘附的细胞中细胞凋亡的典型特征的外观。培养中的上皮细胞会将其形态从最初的长方体形状转变为更细长的外观。与 EMT 一致。

按照系列图像确定电镀后的日期和时间发生这种情况时，请先启动 TTT 程序。选择用户姓名首字母，然后单击 continue。按 set NAS，选择用户创建的 TTT 导出文件夹，然后单击 ok。

在浏览器中，选择一个试验文件夹。选择位置文件夹，然后按加载位置按钮。将眼部因素发送至 10 次。

加载所需的图像数量，通常是所有图像。使用此分析时。第一次在单元格编辑器窗口中，在影片窗口的文件菜单下选择 New colony。

按下轨道单元按钮或按 F 键。开始跟踪单元格。在影片窗口中标识一个单元格，并将光标置于该单元格上。

单击 F 2 后应出现一个带有单元格编号的圆圈。使用数字键盘上的零键跟踪单元格的位置并前进到下一张图片。移动光标以跟随每个单元格在每帧中的位置。

要删除轨道并返回到上一个图像，请按数字键盘上的 Delete 键以向前移动帧而不跟踪单元格，请按 3。要向后移动而不跟踪，请按 1。要在影片窗口中标记细胞分裂，请单击分裂按钮以在影片窗口中标记细胞死亡，单击细胞死亡。

一旦发生分裂，就可以在同一细胞命运图中跟踪子细胞。为此，请转到单元格编辑器窗口并右键单击指定 dotter 单元格的圆圈符号。这将自动启动跟踪模式，现在按 F 10 可保存树。

每个树都将保存在指定的输出文件夹中。要在细胞编辑器窗口中启动新的硫酸盐图谱，请选择打开菜单，单击文件，然后单击。新的集落细胞在成像开始时呈圆形并漂浮。

尺寸棒等于 200 微米 附着到板后，它们变得扁平并呈现出长方体型外观。通过培养 4 天，大多数上皮细胞伸长成类似 EMT 的形态。这种变化发生在所有基因型中，研究的漂浮细胞发育成确定的单个上皮细胞集落。

铺板后 24 小时，连续图像分析显示这些集落是由细胞聚集而不是细胞分裂产生的。虽然 BRCA 的破坏本身并没有改变形成的菌落数量。TP 53 单倍体不足的添加显着减少了形成的集落数量。

同样，在表达上添加 ER α 显着增加了在此程序后形成的菌落数量。可以执行其他采用延时成像结合单细胞追踪的方法，以回答其他问题，例如特定的治疗方法或其他遗传损伤如何改变细胞行为并可能影响治疗反应或癌症进展。