4,028 Views
•
07:11 min
•
April 16, 2021
DOI:
Dit protocol helpt om de ruimtelijke en temporele rekrutering van DNA-schadehersteleiwitten te begrijpen, rekening houdend met de celcyclusfase. Voor celcyclusdiscriminatie gebruiken we fluorescerend eiwitgelabeld PCNA als een marker van de S-fase, die artefacten omzeilt die zijn geïntroduceerd door andere celcyclussynchronisatiemethoden. Dit in combinatie met op laser gebaseerde microbestraling geeft een ongeëvenaarde spatiotemporale resolutie voor DNA-schadeherstel eiwitkinetiek.
Succesvol in routinematig gebruik van ons protocol bouwt voort op basiskennis van confocale beeldvorming. Plaats 24 uur voor de microbestraling in totaal acht bij 10 tot de vierde cellen in 500 microliter tot één milliliter media op een afdekglas met vier goed kamer. Wissel een uur voor de microbestraling het reguliere groeimedium uit met beeldvormend medium dat olaparib of een voertuigcontrole zoals DMSO bevat.
Schakel ten minste vier uur vóór de beeldvorming de omgevingskamer en de microscoopcomponenten in. Schakel de verwarming, kooldioxidetoevoer en de vochtigheidsregelaar in. Initialiseer lichtbronnen samen met de laserlijnen ten minste een uur voordat u de cellen naar de microscoop overbrengt.
Olie het microscoopobject en plaats een kamerglas onder de microscoop. Om S-fasecellen in een asynchrone populatie te selecteren, zoekt u door het oculair naar het unieke lokalisatiepatroon van de mPlum-tag PCNA in S-fase en selecteert u een gezichtsveld met voldoende S-fasecellen voor microbestraling. Stel het gebied in dat van belang is voor microbestraling door de bijbehorende software te gebruiken om binaire lijnen in te voegen.
Om het gewenste aantal regels en afstand in te stellen, klikt u op binair, selecteert u vervolgens lijn, cirkel en ellips invoegen om het gewenste aantal lijnen te tekenen, converteert u deze binaire lijnen in stimulatie-ROI’s door op ROI te klikken, binair naar ROI te verplaatsen, klikt u vervolgens met de rechtermuisknop op een van de ROI’s en selecteert u gebruiken als stimulatie ROI S1. Plaats deze lijnen in het gezichtsveld zodat ze door de kern van de cellen gaan. Vóór microbestraling, om PCNA-foci te identificeren voor latere analyse, maakt u een afbeelding met een hogere resolutie van het gezichtsveld door de benodigde parameters in te stellen in de compacte GUI A1 LFOV en de vensters van het A1 LFOV-scangebied, gevolgd door op de opnameknop te drukken. Om de microbestraling in te stellen, opent u het tabblad ND-stimulatie en opent u vervolgens het tijdschemavenster om een reeks prestimulatiebeelden en vervolgens een reeks poststimulatiebeelden te verkrijgen met behulp van de Galvano-scanners.
Stel drie fasen in het tijdschemavenster in. Selecteer in de kolom acquisitie en stimulatie respectievelijk acquisitie, stimulatie en acquisitie voor de drie fasen. Stel voor de stimulatiefase S1 in als roi.
Stel in het Galvano XY-venster het 100% laservermogen in voor de 405 nanometer laserlijn en stel de verblijftijd in voor microstraling. Als u timelapse-beeldvorming wilt instellen voor het gewenste tijdvenster en de gewenste intervallen, gebruikt u het tijdschema A1 LFOV compact GUI en de A1 LFOV-scangebiedvensters. Optimaliseer het laservermogenspercentage, de versterking en de offset-instellingen om het bleken van foto’s tijdens het maken van afbeeldingen in het compacte GUI-venster A1 LFOV te verminderen.
Afhankelijk van de kinetiek van het eiwit, verleng of verkort u het interval tussen beelden of de duur van de totale timelapse door het gewenste interval en de gewenste duur voor de derde fase-acquisitierij in het tijdsschemavenster in te stellen. Druk nu op run om de microbestraling en de daaropvolgende timelapse-beeldvorming uit te voeren. Sla aan het einde van de timelapse-beeldvorming de stimulatie-RUP’s op als afzonderlijke afbeeldingen, die nuttig zullen zijn voor het identificeren van de coördinaten van microbestraling in alle downstream-software die voor analyse wordt gebruikt.
PCNA heeft een volledig homogene verdeling in de kern in G1- en G2-fasen. In de S-fase lokaliseert PCNA naar plaatsen van DNA-replicatie, die kunnen worden gevisualiseerd als heldere vlekken in de kern. In vroege S-fase cellen zijn de vlekken relatief klein en gelijk verdeeld over de kern van de cel.
Terwijl ze zich in het midden van de S-fase ontwikkelen, worden de vlekken wazig en lokaliseren ze meer naar de omtrek van de kern en de nucleoli. In de late S-fase nemen de vlekken in aantal af, maar worden ze steeds groter naarmate PCNA zich concentreert op late replicatielocaties. Lage doses energie, zoals 1.000 microseconden verblijftijd, induceren geen rekrutering van EGFP-FBXL10, een dubbelstrengs break responder, maar zijn voldoende om rekrutering van NTHL1-mCherry te induceren, een base excisie reparatie pathway eiwit dat wordt gerekruteerd naar plaatsen van oxidatieve DNA-schade.
Na een verblijftijd van 3.000 microseconden worden zowel EGFP-FBXL10 als NTHL1-mCherry gerekruteerd, wat een laseruitvoer aantoont die zowel oxidatieve laesies als dubbelstrengsbreuken genereert. EXO1b bereikt ongeveer een minuut een maximaal niveau van accumulatie en microbestralingsplaatsen en begint dan langzaam los te gaan van de DNA-laesies. In aanwezigheid van olaparib is de accumulatie van EXO1b op de laserstreep op één minuut aanzienlijk minder in vergelijking met de voertuigbesturing.
Het is van cruciaal belang dat de microscoop voldoende tijd krijgt om op te warmen en dat de cultuur en omstandigheden optimaal zijn voor elk experiment om consistente resultaten te garanderen. Daarnaast is het belangrijk om uw laserinstellingen te optimaliseren met verschillende DNA-schadeverslaggevers om te testen op specifieke DNA-laesies. Overweeg na microbestraling om resultaten te valideren met klassieke biochemische methoden, zoals fractionering, immunoprecipitatie of ChIP.
Deze benaderingen bemonsteren een grotere celpopulatie en bieden dus statistische sterkte.
Dit protocol beschrijft een niet-invasieve methode om S-fase cellen efficiënt te identificeren voor downstream microscopiestudies, zoals het meten van DNA-reparatie eiwitrekrutering door lasermicrobestraling.
Read Article
Cite this Article
Miwatani-Minter, B., Rona, G. Laser Micro-Irradiation to Study DNA Recruitment During S Phase. J. Vis. Exp. (170), e62466, doi:10.3791/62466 (2021).
Copy