Lasermikrobestråling for å studere DNA-rekruttering i S-fase

Denne protokollen bidrar til å forstå den romlige og tidsmessige rekrutteringen av DNA-skadereparasjonsproteiner, med tanke på cellesyklusfasen. For cellesyklusdiskriminering bruker vi fluorescerende proteinmerket PCNA som en markør for S-fase, som omgår artefakter introdusert av andre cellesyklussynkroniseringsmetoder. Dette kombinert med laserbasert mikrobestråling gir uovertruffen romlig oppløsning på DNA-skadereparasjon av proteinkinetikk.

Vellykket i rutinemessig utnyttelse av protokollen vår bygger på grunnleggende kunnskap om konfomisk avbildning. 24 timer før mikrobestrålingen, plate totalt åtte med 10 til fjerde celler i 500 mikroliter til en milliliter medier på en fire-brønns kamret dekkglass. En time før mikrobestrålingen bytter du det vanlige vekstmediet med bildemediet som inneholder enten olaparib eller en kjøretøykontroll som DMSO.

Slå på miljøkammeret og mikroskopkomponentene minst fire timer før avbildning. Slå på varme-, karbondioksidtilførselen og fuktighetsregulatoren. Initialiser lyskilder sammen med laserlinjene minst en time før du overfører cellene til mikroskopet.

Olje mikroskopets mål og legg et kammeret dekselglass under mikroskopet. Hvis du vil velge S-faseceller i en asynkron populasjon, ser du gjennom okularet etter det unike lokaliseringsmønsteret til mPlum-kodede PCNA i S-fasen og velger et synsfelt som har nok S-faseceller til mikrobestråling. Angi interesseområdet for mikrobestråling ved å bruke den tilknyttede programvaren til å sette inn binære linjer.

Hvis du vil angi ønsket antall linjer og avstand, klikker du binært, velger sett inn linje, sirkel og ellipse for å tegne ønsket antall linjer, og deretter konverterer du disse binære linjene til stimulerings-ROIer ved å klikke ROI, flytte binært til avkastning, høyreklikke en av ROIene og velge bruk som stimulerings-ROI S1. Plasser disse linjene i synsfeltet slik at de passerer gjennom kjernen i cellene. Før mikrobestråling, for å identifisere PCNA-foci for senere analyse, ta et høyere oppløsningsbilde av synsfeltet ved å angi de nødvendige parametrene i A1 LFOV kompakt GUI og A1 LFOV-skanneområdevinduene etterfulgt av å trykke på opptaksknappen. Hvis du vil konfigurere mikrobestrålingen, åpner du kategorien ND-stimulering, og deretter åpner du tidsplanvinduet for å hente en serie bilder før stimulering og deretter en serie bilder etter stimulering ved hjelp av Galvano-skannerne.

Definer tre faser i tidsskjemavinduet. I anskaffelses- og stimuleringskolonnen velger du henholdsvis anskaffelse, stimulering og anskaffelse for de tre fasene. For stimuleringsfasen, sett S1 som avkastning.

I Galvano XY-vinduet angir du 100 % lasereffekt for 405 nanometerlaserlinjen og angir oppholdstiden for mikrobestråling. Hvis du vil konfigurere tidsforløpavbildning for ønsket tidsvindu og intervaller, bruker du tidsplanen A1 LFOV compact GUI og A1 LFOV-skanneområdevinduene. Optimaliser lasereffektprosenten, forsterkningen og offset-innstillingene for å redusere fotobleking under bildebehandling i A1 LFOV kompakt GUI-vindu.

Avhengig av proteinets kinetikk, utvid eller forkort intervallet mellom bilder eller varigheten av det totale tidsforløpet ved å angi ønsket intervall og varighet for den tredje faseanskaffelsesraden i tidsplanvinduet. Trykk på kjør nå for å utføre mikrobestrålingen og den påfølgende tidsforløpavbildningen. På slutten av tidsforløpavbildningen lagrer du stimulerings-ROIene som separate bilder, noe som vil være nyttig for å identifisere koordinatene for mikrobestråling i nedstrøms programvare som brukes til analyse.

PCNA har en helt homogen fordeling i kjernen i G1- og G2-faser. I S-fase lokaliserer PCNA til steder for DNA-replikasjon, som kan visualiseres som lyse flekker i kjernen. I tidlige S-faseceller er flekkene relativt små og like fordelt gjennom cellens kjerne.

Mens du går inn i midten av S-fasen, blir flekkene uskarpe og lokaliserer mer mot omkretsen av kjernen og kjernen. I slutten av S-fasen reduseres flekkene i antall, men blir stadig større etter hvert som PCNA konsentrerer seg på sene replikeringssteder. Lave doser energi, som 1000 mikroseconds av oppholdstid, induserer ikke rekruttering av EGFP-FBXL10, en dobbeltstrenget break responder, men er tilstrekkelig til å indusere rekruttering av NTHL1-mCherry, et grunnleggende eksisjonsreparasjonsveiprotein som rekrutteres til steder med oksidativ DNA-skade.

Ved 3.000 mikroseconds oppholdstid, både EGFP-FBXL10 og NTHL1-mCherry rekrutteres, demonstrerer en laser utgang som genererer både oksidative lesjoner og dobbeltstrengede pauser. EXO1b når et maksimalt nivå av akkumulerings- og mikrobestrålingssteder rundt ett minutt, og begynner deretter sakte å koble seg fra DNA-lesjonene. I nærvær av olaparib er akkumulering av EXO1b ved laserstripen på ett minutt betydelig mindre sammenlignet med kjøretøykontrollen.

Det er avgjørende at mikroskopet får god tid til å varme opp og at kultur og forhold er optimale for hvert eksperiment for å sikre konsistente resultater. I tillegg er det viktig å optimalisere laserinnstillingene dine med forskjellige DNA-skadereportere for å teste for spesifikke DNA-lesjoner. Etter mikrobestråling bør du vurdere å validere resultater med klassiske biokjemiske metoder, for eksempel fraksjonering, immunoprecipitation eller ChIP.

Disse tilnærmingene prøver en større cellepopulasjon, og gir dermed statistisk styrke.