Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
CRISPR-Cas9-मध्यस्थता सटीक नॉक-इन संपादन ज़ेब्राफिश हार्ट्स में
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
यह प्रोटोकॉल CRISPR-Cas9 तकनीक का उपयोग करके ज़ेब्राफिश भ्रूण में सटीक नॉक-इन संपादन की सुविधा के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन करता है। लॉन्ग क्यूटी सिंड्रोम से जुड़े जीन वेरिएंट को मॉडल करने के लिए इन तकनीकों की प्रयोज्यता को प्रदर्शित करने के लिए एक फेनोटाइपिंग पाइपलाइन प्रस्तुत की गई है।
Transcript
हमारा प्रोटोकॉल सीआरआईएसपीआर संपादनों के सटीक एकीकरण और सरल दृश्य पहचान दोनों के लिए एक पाइपलाइन प्रदान करता है, साथ ही पोस्ट-एडिट फेनोटाइपिंग का एक उदाहरण भी प्रदान करता है। इस दृष्टिकोण का मुख्य लाभ सीआरआईएसपीआर संपादन का पता लगाने में आसानी है, जिससे सफल संपादनों की कुशल और सरलीकृत पहचान की अनुमति मिलती है। यह दृष्टिकोण ज़ेबराफ़िश में रोग से जुड़े वेरिएंट के सरल उत्पादन और लक्षण वर्णन की अनुमति देता है।
यहां, हम लंबे क्यूटी सिंड्रोम की जांच कर रहे हैं। दवा उपचारों पर अनुवर्ती अध्ययन तब पता लगाने के लिए संभव हैं। रुचि के जीन के लिए ज़ेबराफिश ऑर्थोलॉग की पहचान करके नॉक-इन लक्ष्य साइट अनुक्रम को एक्साइज करने के लिए दो एसजीआरएनए गाइड डिजाइन करके शुरू करें।
रुचि के जीन अनुक्रम के भीतर लक्ष्य साइट का पता लगाने के लिए एन्सेम्बल का उपयोग करें, जिसमें टेम्पलेट बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले दो किलोबेस फ्लैंकिंग अनुक्रम शामिल हैं। CRISPOR जैसे डिज़ाइन सॉफ़्टवेयर टूल का उपयोग करें और डैनियो रेरियो प्रजातियों और कैस एंजाइम का चयन करें। दो एसजीआरएनए दृष्टिकोण के लिए, लक्ष्य एक्सॉन से पहले एक एसजीआरएनए चुनें और तत्काल डाउनस्ट्रीम इंट्रॉन के भीतर एक दूसरा एसजीआरएनए चुनें।
सुनिश्चित करें कि चयनित एसजीआरएनए में उच्च विशिष्टता और कम अनुमानित ऑफ-टारगेट बाइंडिंग है। न्यूनतम ऑफ-टारगेट बाइंडिंग वाले गाइड की पहचान करने के लिए CRISPOR रैंकिंग का उपयोग करें। अब पीसीआर-आधारित सेंगर अनुक्रमण जीनोटाइपिंग के लिए सबसे संभावित ऑफ-टारगेट साइटों की पहचान करें।
दो एसजीआरएनए का चयन करने के बाद, प्रत्येक के लिए रिवर्स पूरक प्राप्त करें, दो पूरक ऑलिगोस जो उत्परिवर्तन से पहले होते हैं और उत्परिवर्तन के डाउनस्ट्रीम दो पूरक ऑलिगोस। पसंद के प्लास्मिड में गाइड को शामिल करने के लिए प्रत्येक ऑलिगो पर संगत प्रतिबंध साइटें जोड़ें। डीआर 274 प्लास्मिड में चयनित गाइड अनुक्रमों के एकीकरण के लिए, पांच प्रमुख बीएसए 1 प्रतिबंध साइट का उपयोग करके एक ओवरहैंग बनाएं और गाइड के पांच प्रमुख सिरों पर बीएसए 1 मान्यता साइटों को इंजीनियर करें।
इसके बाद, दो अनुक्रम टुकड़ों को चुनकर जेब्राफिश में एचडीआर के लिए बहिर्जात टेम्पलेट डिजाइन करें जो पीकेएचआर 5 प्लास्मिड में रखे गए एम शिरापरक वाईएफपी रिपोर्टर जीन को फ्लैंक करेंगे। टेम्पलेट को एम शिरापरक वाईएफपी रिपोर्टर जीन के दोनों ओर डालने के लिए दो खंडों में विभाजित करें। सुनिश्चित करें कि कोडिंग अनुक्रम को काटने से बचने के लिए विभाजित साइट एक इंट्रोन में है।
पीकेएचआर 5 प्लास्मिड में क्लोनिंग की सुविधा के लिए पांडुलिपि में उल्लिखित सभी आवश्यक संशोधनों को शामिल करें। निषेचन के लगभग 40 मिनट बाद भ्रूण को एक सेल चरण में इंजेक्ट करें। निषेचन के तीन दिनों के बाद, जेब्राफिश लार्वा को 0.3% एमएस 222 युक्त 25 मिलीमीटर पेट्री डिश में स्थानांतरित करके एनेस्थेटाइज करें जब तक कि वे अपने आत्म-सही रिफ्लेक्स को खो न दें।
एक बार एनेस्थेटाइज्ड होने के बाद, लार्वा को 24-वेल प्लेट के कुएं में स्थानांतरित करें। जीएफपी या वाईएफपी का पता लगाने में सक्षम माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, लार्वा की आंखों में रिपोर्टर जीन फ्लोरेसेंस के लिए स्क्रीन करें। लार्वा की छवियों को कैप्चर करने के बाद, रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति की उपस्थिति या अनुपस्थिति का दस्तावेजीकरण करें।
सटीक और सटीक एचडीआर जीन संपादन की पुष्टि करने के लिए, पहले निषेचन के तीन दिन बाद लार्वा को एनेस्थेटाइज करके जीनोटाइपिंग करें जैसा कि पहले दिखाया गया था और हॉटशॉट विधि का उपयोग करके पूंछ क्लिप से जीनोमिक डीएनए को अलग करना। एक्साइज्ड टेल क्लिप को 25 मिलीमोलर सोडियम हाइड्रॉक्साइड के 15 माइक्रोलीटर में जोड़ें और इसे 20 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेट करें, फिर ट्राइस हाइड्रोक्लोरिक एसिड के 1.5 माइक्रोलीटर के साथ बेअसर करें। सेंट्रीफ्यूज 30 सेकंड के लिए 13,800 गुना जी पर, और निकाले गए जीनोमिक डीएनए युक्त सुपरनैटेंट को बनाए रखें।
ई 3 मीडिया में लार्वा को पुनर्प्राप्त करें और यदि आगे के अध्ययन का इरादा है तो इसे आवास प्रणाली में वापस कर दें। निकाले गए जीनोमिक डीएनए को टेम्पलेट के रूप में उपयोग करते हुए, ऑन-टारगेट और संभावित ऑफ-टारगेट साइटों का पीसीआर-आधारित सेंगर अनुक्रमण करें। सुनिश्चित करें कि ऑन-टारगेट प्राइमर डिज़ाइन उत्परिवर्तन साइट और निकटतम एसजीआरएनए बाइंडिंग साइट को कैप्चर करता है।
रुचि के जीन में एकीकरण की पुष्टि करने के लिए सम्मिलित होमोलॉजी आर्म और लक्ष्य जीन से संक्रमण का पता लगाने के लिए एक अलग अनुक्रमण प्राइमर डिजाइन करें। शीर्ष तीन संभावित ऑफ-टारगेट साइटों को अनुक्रमित करने के लिए प्राइमर डिज़ाइन करें। प्रत्येक ज़ेबराफिश के लिए पहचाने जाने योग्य ऑन और ऑफ-टारगेट जीनोटाइपिंग, हृदय गति, पेरिकार्डियल आयाम, ईसीजी फेनोटाइपिंग और रिपोर्टर जीन डेटा संकलित करें।
वाईएफपी एम शिरापरक रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति द्वीपों में देखी गई थी, जो सफल टेम्पलेट एकीकरण के सकारात्मक रिपोर्टर के रूप में कार्य करती थी। रिपोर्टर जीन पॉजिटिव मछली में सटीक संपादन जी 2 ए पाया गया जो आर 56 क्यू संस्करण को जेडकेसीएएनएच 6 ए में पेश करता है। आंख क्षेत्र के अनुपात के रूप में पेरिकार्डियल आयामों का माप यहां दिखाया गया है।
जेब्राफिश में कार्डियक रिपोलराइजेशन के विकारों से जुड़े पेरिकार्डियल एडिमा में वृद्धि के साथ ब्रैडीकार्डिया की प्रवृत्ति आर 56 क्यू जीन संपादित लार्वा में देखी गई थी। निषेचन के तीन दिन बाद ज़ेबराफिश लार्वा दिल से ईसीजी रिकॉर्डिंग यहां दिखाई गई है। इस दृष्टिकोण का सबसे महत्वपूर्ण पहलू गाइड डिज़ाइन है, जैसा कि अक्सर सीआरआईएसपीआर प्रक्रियाओं में होता है।
सफल CRISPR संपादन के लिए प्रभावी गाइड आवश्यक हैं। वैकल्पिक सीआरआईएसपीआर विधियों का पालन किया जा सकता है जो अधिक परिशुद्धता या अन्य कार्यक्षमताओं की अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, बड़े जीन डाले जा सकते हैं जैसे कि एक प्रमुख संपादन परिसर जो विवो इंड्यूसेबल संपादन प्रणाली प्रदान करता है।
Tags
जीव विज्ञान अंक 187 CRISPR-Cas9 ज़ेब्राफिश होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत एचईआरजी लॉन्ग क्यूटी सिंड्रोमRelated Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
