Direcionamento de genes altamente eficientes mediados por CRISPR/Cas9 em células-tronco embrionárias para o desenvolvimento de modelos de camundongos manipulados por genes

Produzir camundongos geneticamente modificados e analisar seu fenótipo nos permite entender as funções genéticas específicas em detalhes, in vivo. Numerosas descobertas importantes foram descobertas usando modelos animais modificados por genes. O método que descrevemos aqui permite que o DNA longo implante células-tronco com eficiência aceitável para sem seleção de drogas.

A técnica é benéfica não apenas para as ciências básicas da vida, mas as descobertas também serão implementadas em ciências aplicadas, como ciência médica e ciência animal. Demonstrando o procedimento estarão o Dr. Chihiro Emori, professor assistente, e o Dr. Manabu Ozawa, professor associado do meu laboratório. Depois de preparar o fibroblasto embrionário do rato, preparar a placa de cultura celular revestida de gelatina, conforme descrito no manuscrito, e incubá-la durante duas horas numa incubadora húmida.

Retire a solução de gelatina, lave o prato duas vezes com PBS e guarde-o à temperatura ambiente até à sua utilização. Descongele o estoque de MEF congelado mitoticamente inativado usando um banho-maria temperado a 37 graus Celsius por um minuto. Um dia antes da semeadura ESC, coloque o MEF em um prato de 60 milímetros revestido de gelatina.

Descongele um tubo de estoque ESC congelado, como mostrado anteriormente, e coloque uma vez de 10 a quintas ESCs em um prato de 60 milímetros contendo MEF pré-semeado. Em seguida, adicione quatro mililitros de meio de cultura ESC e incube o prato até que o ESC atinja 50 a 70% de confluência. Após lavar o ESC cultivado com quatro mililitros de PBS, digeri-los com 800 microlitros de solução de EDTA a 0,25% de tripsina por cinco minutos a 37 graus Celsius.

Uma vez que a tripsina é inativada com um mililitro de ESCM, adicione um mililitro de ESCM fresco às células, transfira o meio para um tubo e pellet as células por centrifugação a 280 G por cinco minutos. Depois de ressuspender as células em um mililitro de ESCM fresco, conte a concentração celular usando um contador de células com coloração azul de tripano. Depois de transferir uma vez 10 para o quinto ESCs para um novo tubo de 1,5 mililitro e lavá-los três vezes com PBS por centrifugação, ressuspenda o pellet ESC em 12 microlitros de mistura de DNA Cas9 RNP e misture bem por pipetagem suave para evitar borbulhar.

Em seguida, sirva o ESC suspenso para eletroporação. Em seguida, cultive as ESCs eletroporadas em um prato de 60 milímetros contendo quatro mililitros de ECSM com MEF mitoticamente inativado e continue trocando o meio diariamente. Três a cinco dias após a eletroporação, lave as ESCs com quatro mililitros de PBS e digeri-as com 800 microlitros de EDTA de tripsina a 0,25% e cultura em incubadora úmida.

Depois, adicione dois mililitros de ESCM para parar a digestão da tripsina. Uma vez que a mistura celular é peletizada, ressuscite o pellet em um mililitro de ESCM fresco e conte a concentração celular usando um contador de células com coloração azul de tripano. Passagem dos ESCs de uma só vez 10 para a terceira célula por prato de 60 milímetros contendo ESCM e alimentador MEF.

Certifique-se de mudar o meio até que a colônia pega. Cinco a sete dias após a primeira passagem, uma vez aspirado o ESCM do prato de cultura ESC, adicione quatro mililitros de PBS. Usando uma pipeta de 20 microlitros, pegue colônias ESC únicas com cinco microlitros de PBS sob um estereomicroscópio.

Coloque as colônias individuais em um poço de uma placa de fundo redondo de 96 poços contendo 15 microlitros de solução de EDTA a 0,25% de tripsina. Depois de incubar a placa de 96 poços, pare a digestão da tripsina adicionando 80 microlitros de ESCM e dissociando as colônias de ESC em células únicas por pipetação. Para a genotipagem por PCR, transfira 40 microlitros de suspensão ESC para uma placa de 96 poços revestida de gelatina, livre de alimentadores, contendo 50 microlitros de ESCM por poço.

Para fazer o estoque ESC congelado, transfira os 60 microlitros restantes de suspensão ESC para um poço de uma placa de 24 poços revestida de gelatina contendo 500 microlitros de ESCM e alimentador MEF. Armazene clones ESC individuais cultivados na placa de 24 poços até atingirem 60 a 80% de confluência e recuperem clones ESC individuais por tripsinização, como demonstrado anteriormente. Depois de obter o pellet celular por centrifugação, ressuspeite o meio de congelamento celular em 500 microlitros para congelar as células a menos 80 graus Celsius.

Para a genotipagem por PCR, cultive clones de ESC como demonstrado anteriormente e remova a ESCM de cada poço por aspiração antes de lavá-lo com 100 microlitros de PBS duas vezes. Depois de aspirar o PBS, adicione 100 microlitros de tampão de lise contendo proteinase K e misture bem. Agora transfira o lisado ESC para um novo tubo de 1,5 mililitro e mantenha-o em uma câmara de calor a 65 graus Celsius por pelo menos uma hora.

Uma vez que o DNA genômico é dissolvido em 20 microlitros de água livre de DNase, determine a pureza e a concentração de DNA usando um espectrofotômetro. Depois de realizar a PCR genômica usando conjuntos de primer específicos do locus para amplificar a região alvo, verifique a sequência e escolha os clones ESC com as sequências knock-in desejadas. Depois de acasalar as fêmeas tratadas com o hormônio com os machos ICR e coletar o oviduto, coloque os ovidutos coletados em gotas de FHM e recupere os embriões de estágio de duas células ou quatro células lavando o oviduto com FHM usando uma agulha de lavagem inserida no infundíbulo.

Lave os embriões coletados movendo-os para várias gotas frescas de FHM usando uma pipeta bucal. Cultive os embriões em 50 microlitros de gotas de KSOM em uma placa de cultura celular de 35 milímetros coberta com óleo mineral, conforme demonstrado anteriormente por um dia até que o estágio de oito células ou mórula seja atingido. Prepare pipetas de vidro para segurar os embriões e a injeção de ESC usando um extrator e microforja.

Depois de integrar uma pipeta de retenção contendo FHM em um suporte capilar conectado a um microinjetor, configure-o no lado esquerdo do micromanipulador. Conecte uma pipeta de injeção a outro microinjetor e configure-a no lado direito. Alinhe as duas pipetas diretamente no campo de visão do microscópio.

Faça gotas de cinco microlitros de pirrolidona 12% polivinil e gotas de cinco microlitros de FHM na mesma tampa de um prato de 60 milímetros, lado a lado. Cubra as gotas com óleo mineral. Transfira os embriões em cinco microlitros de gota de FHM e adicione um a cinco microlitros da suspensão ESC à gota de FHM contendo embriões.

Uma vez que a pipeta de injeção é lavada com pirrolidona de polivinila, mova a pipeta de injeção para a gota contendo os embriões e ESCs. Escolha três duplos ESC individuais que acabaram de terminar sua divisão celular na pipeta de injeção. Usando a pipeta de retenção, segure um embrião de oito células ou estágio de mórula que tenha completado a compactação por aspiração e faça um buraco na zona pelúcida com um pulso piezoelétrico.

Expulse o ESC de seis células dentro da zona pelúcida e puxe a pipeta para fora dos embriões. Lave os embriões injetados com ESC com várias gotas de KSOM suavemente usando uma pipeta bucal e incube-os em uma nova gota de KSOM de 50 microlitros coberta com óleo mineral, como demonstrado anteriormente, até que os embriões se desenvolvam para o estágio de blastocisto. Um amplificador de PCR de tamanho específico para o alvo knock-in é obtido e 9 dos 22 clones mostraram uma banda específica de knock-in.

Esses resultados são eficientes e reprodutíveis para knock-in de genes sem nenhuma seleção de drogas. Pegar o tamanho ideal das colônias ESC é bastante importante para este procedimento. Evite selecionar colônias que são muito grandes ou muito pequenas.

A edição direta do genoma mediada por CRISPR Cas9 usando um zigoto seria aplicável para a criação de camundongos knockout de genes simples. Este protocolo de direcionamento de genes ESC mediado por CRISPR Cas9 facilita a produção de vários camundongos geneticamente modificados para análises futuras em ciências da vida.