Estabelecendo culturas mistas de células neuronais e gliais de cérebros embrionários de camundongos para estudar infecção e imunidade inata
June 30th, 2023
Este protocolo apresenta uma maneira única de gerar culturas de células do sistema nervoso central a partir de cérebros embrionários de camundongos do dia 17 para pesquisa em neuro(imuno)logia. Este modelo pode ser analisado usando várias técnicas experimentais, incluindo RT-qPCR, microscopia, ELISA e citometria de fluxo.
A última questão de pesquisa do meu projeto é descobrir como podemos manipular as respostas imunes inatas do sistema nervoso central para proteger contra infecções virais. Atualmente, pesquisamos sua resposta à proteína interferon beta profundamente antiviral. Um desafio experimental é gerar células suficientes para permitir uma investigação detalhada.
Cada resultado precisa ser validado usando várias técnicas e isso pode, infelizmente, resultar no abate de muitos animais. Devido ao grande número de células geradas por esta nova técnica de cultura, muitas condições experimentais diferentes podem ser investigadas a partir de uma rata prenha. Além disso, o uso de alternativas in vitro, sempre que possível, também diminui muito o sofrimento animal.
Este método reduz e refina o uso animal, seguindo de perto os princípios dos três Rs.Este método de cultura pode ser usado para abordar muitas questões de pesquisa diferentes usando uma variedade de métodos de leitura, como ELISA, qPCR, microscopia e citometria de fluxo. Essa técnica pode ajudar outros pesquisadores a reduzir e refinar o uso de animais. Esperamos melhorar nossa compreensão da resposta antiviral inata, modulando-a para proteger contra vírus oportunistas, como o poliomavírus humano 2, ou o vírus John Cunningham, como é comumente conhecido, o principal agente da LMP, que pode ser um efeito colateral grave das drogas imunossupressoras usadas para tratar a EM e outras doenças.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Visão geral
Este estudo apresenta um novo método para gerar culturas celulares do sistema nervoso central a partir de cérebros de camundongos no dia embrionário 17, visando compreender as respostas imunes inatas a infecções virais. A plataforma permite análises detalhadas através de técnicas experimentais como RT-qPCR, microscopia, ELISA e citometria de fluxo, visando, em última análise, ajudar na redução do uso de animais em pesquisas.
Componentes-chave do estudo
Área da ciência
- Neuro(imuno)logia
- Técnicas de cultura celular
- Estudos de infecção viral
Fundo
- O estudo concentra-se em manipular as respostas imunes inatas do sistema nervoso central.
- Explora os efeitos do interferon beta, uma potente proteína antiviral.
- Métodos tradicionais de cultura celular frequentemente levam ao abate de animais.
- Esta nova técnica permite uma geração de células mais eficiente, reduzindo o sofrimento animal.
Propósito do estudo
- Investigar como proteger o sistema nervoso central contra infecções virais.
- Avaliar múltiplas condições experimentais de um único camundongo.
- Melhorar a compreensão da resposta antiviral inata no contexto de doenças como esclerose múltipla.
Métodos utilizados
- As culturas celulares foram derivadas de cérebros de camundongos no dia embrionário 17.
- As células foram analisadas usando RT-qPCR, microscopia, ELISA e citometria de fluxo para validar os resultados.
- Procedimentos detalhados para colheita e cultura de células, incluindo reagentes específicos e etapas de incubação, foram seguidos.
- Os principais marcadores para análise incluíram NG2, nestin, SMI31, MBP, NeuN, CNP, GFAP e Iba1.
Principais resultados
- O método gerou um número suficiente de células viáveis para uma análise abrangente.
- As investigações revelaram a superexpressão do mRNA de Ccl5 e sua correlação com a expressão de proteínas.
- Uma presença diversificada de micróglia, neurônios e astrócitos foi observada, enfatizando a eficiência do método.
- A citometria de fluxo indicou que 70% das células permaneceram viáveis após a cultura.
Conclusões
- Este estudo demonstra um método refinado para gerar culturas celulares do SNC, reduzindo a dependência de modelos animais.
- O método contribui significativamente para a pesquisa neuro(imuno)lógica, particularmente na compreensão das respostas virais.
- As implicações se estendem para uma melhor modelagem de doenças e insights sobre os mecanismos de proteção do SNC.
