Cultura primária de neurônios isolados do cerebelo embrionário do rato
October 26th, 2019
Realizar experimentos in vitro para refletir as condições in vivo da forma mais adequada possível não é uma tarefa fácil. O uso de culturas celulares primárias é um passo importante para a compreensão da biologia celular em um organismo inteiro. O protocolo fornecido descreve como crescer com sucesso e cultura embrionária mouse neurônios cerebelares.
A cultura celular neuronal primária é um sistema modelo ideal para estudar neurônios dissociados na cultura in vitro. A vantagem de usar este método é ser capaz de manter as características celulares de células dissociadas, como mecanismos, funções e morfologia em condições in vitro por algumas semanas o mais próximo possível da condição in vivo. Coloque os deslizamentos de cobertura redonda em uma placa de 24 poços sob o armário de biossegurança.
Adicione 90 microliters de poli-L-ornithine em cada deslizamento de cobertura. Feche a tampa e coloque suavemente a placa na incubadora de 37 graus por dois dias. Prepare o meio de cultura e o meio de semeadura e mantenha-os a quatro graus Celsius.
Prepare a solução de trippsina de trabalho no DMEM/F12 e mantenha-a em quatro graus. Coloque o meio de cultura e semeadura na incubadora a 37 graus. Tire a placa de 24 poços da incubadora.
Lave os deslizamentos da tampa três vezes com água destilada dupla. Deixe os deslizamentos de cobertura por pelo menos duas horas para secar completamente. Prepare três pratos de Petri recheados com PBS frio, três pratos de Petri cheios de HBSS frios, e cinco pratos de Petri cheios de meio de dissecção fria no gelo.
Extirpa os chifres uterinos e lave-os em PBS frio três vezes no gelo. A partir daqui, todos os passos devem ser realizados no gelo para minimizar os danos nos tecidos. Após a última etapa de lavagem, separe os filhotes do útero no HBSS e transfira-os para o meio de dissecção a frio.
Em meio de dissecação, decapite os filhotes com uma tesoura. Abra o calvarium do forame magnum até a borda inferior da cavidade orbital. Usando um par de fórceps finos, remova a base do crânio e descasque o crânio do cérebro.
Remova cuidadosamente as meninges do cerebelo a partir da superfície lateral do peduncle cerebelar médio e dos pons. Corte os dois peduncles cerebelares e separe o cerebelo do resto do cérebro. Coloque imediatamente a cerebella coletada em um tubo cônico estéril de 15 mL cheio de DMEM/F12 no gelo.
Centrifugar o tubo a 1.000 g a quatro graus durante um minuto no DMEM/F12. Repita isso três vezes, cada vez que remover suavemente o supernaente com uma pipeta e suspender a pelota em DMEM/F12 fresco. Adicione dois mililitros de trippsina pré-aquecida e pipeta suavemente para misturá-los.
Coloque o tubo em um banho de água de 37 graus por 12 minutos. Após a incubação, leve o tubo para o gabinete de segurança e adicione 10 mLs de DMEM/F12 para inativar a trippsina. Centrifugar a mistura a 1.200 g's por cinco minutos.
Descarte o supernatante e resuspend em meio fresco seguido de centrifugação três vezes. Pré-molhar uma pipeta de plástico estéril com DMEM/F2. Adicione 3,5 mililitros de solução de trabalho DNAse ao mesmo tubo.
Triturar o tecido com uma pipeta várias vezes até que o fluido atinja uma cor leitosa homogênea. Adicione 10 mL de DMEM/F12 frios à mistura e prossiga para a centrífuga. Centrifugar a amostra a 1.200 g a quatro graus por cinco minutos.
Remova cuidadosamente o supernatante sem perturbar a pelota. Remova o meio de semeadura da incubadora. Adicione 500 microliters de meio de semeadura pré-enlatado e misture-o bem usando a pipeta.
Conte as células usando um hemócito. Diluir a suspensão celular com meio de semeadura a uma densidade de 500.000 células por mililitro. Adicione 90 microliters da mistura a cada poço no centro da tampa.
Coloque a placa na incubadora a 37 graus durante três a quatro horas. Após a incubação, adicione 500 microliters de meio de cultura pré-guerra em cada poço. Substitua a placa na incubadora a 37 graus.
Após sete dias, substitua o antigo meio por meio de cultura fresca II.Prepare uma placa separada de 24 poços com organização numérica correspondente e adicione 100 microliters de PFA 4% a cada poço. Após os dias desejados na cultura, remova suavemente os deslizamentos de cobertura dos poços da placa de cultura original e coloque-os nos poços correspondentes da placa PFA descritos na etapa anterior. Adicione PFA aos poços para imergir completamente os deslizamentos de cobertura.
Mantenha a placa PFA em quatro graus por 30 a 120 minutos. Após a incubação, restaure a placa à temperatura ambiente. Lave os deslizamentos da tampa suavemente com PBS por cinco minutos três vezes.
A figura dois no texto mostra a cultura celular cerebelar a partir do E18. A imunofluorescência para calbinino mostra neurônios Purkinje com extensões axonais por três dias in vitro. Por sete a dez dias in vitro, processos dendráticos são evidentes.
Em 21 dias, complexos ramos dendráticos estão presentes. A figura três do texto mostra culturas de células cerebelares começando em vários dias embrionários. a detecção de imunofluorescência de calbinino mostra neurônios Purkinje com axônios precoces somente após 18 dias in vitro.
As culturas de neurônios purkinje iniciadas no E14 e no E15 desenvolverão dendritos, mas nunca tão complexas quanto aquelas que se desenvolvem quando o E18 é o ponto de partida. A figura quatro do texto mostra que diferentes tipos de células se desenvolvem a partir de culturas E18 após 21 dias in vitro. Imunofluorescência verde calbinina mostra neurônios Purkinje.
Imunofluorescência vermelha para parvalbumina em B e C mostram interneurônios inibitórios. A imunofluorescência vermelha para canal fechado de tensão de sódio em E e F mostra neurônios de grânulo. O presente protocolo é econômico e de fácil conduta.
No final deste vídeo, você será capaz de coletar e cultivar neurônios cerebelares e corrigi-los em DIVs desejados.
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Visão Geral
Este estudo descreve um protocolo para cultivar com sucesso neurônios cerebelares embrionários de camundongo in vitro, espelhando condições in vivo. Ao usar cultura de células neuronais primárias, os pesquisadores podem entender melhor as características celulares, mecanismos e funções associadas aos neurônios cerebelares.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Desenvolvimento Neuronal
Fundamentos
- Conduzir experimentos in vitro que refletem condições in vivo é desafiador.
- Culturas celulares primárias oferecem insights sobre a biologia celular dentro de um organismo.
- O cerebelo é crucial para o controle motor e funções cognitivas.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo detalhado para o cultivo e crescimento de neurônios cerebelares.
- Facilitar a pesquisa sobre as características das células neuronais in vitro.
- Permitir estudos adicionais sobre o desenvolvimento e função dos neurônios cerebelares.
Métodos Utilizados
- A principal plataforma utilizada é a cultura de células neuronais primárias.
- O modelo biológico consiste em neurônios cerebelares embrionários de camundongo.
- Etapas importantes incluem extração de tecido, tripsinização e semeadura de células.
- As culturas celulares são mantidas sob condições específicas para maturação e análise.
Principais Resultados
- Neurônios de Purkinje exibem crescimento axonal precoce e depois desenvolvem estruturas dendríticas complexas in vitro.
- Diferentes dias iniciais embrionários produzem resultados de desenvolvimento variados nos neurônios.
- O protocolo é simples, econômico e aplicável para estudos neuronais.
Conclusões
- Este estudo fornece uma abordagem valiosa para o cultivo de neurônios cerebelares.
- Os resultados aprimoram nossa compreensão do desenvolvimento neuronal e características in vitro.
- O protocolo é benéfico para pesquisas futuras sobre funções e distúrbios neurológicos.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Establishing reliable in vitro models of cerebellar neurons supports target validation in neurodevelopmental and neurodegenerative disease research. Primary cultures enable mechanistic de-risking by preserving neuronal morphology, electrophysiology, and marker expression over extended periods. This approach enhances predictive confidence in early discovery by providing a disease-relevant system for screening and pathway analysis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in cerebellar pathways using dissociated neurons that retain in vivo-like features.
- Operational Value: Supports functional target validation through longitudinal monitoring of Purkinje neuron maturation and dendritic complexity.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by modeling embryonic-stage neuronal development relevant to early-onset neurological disorders.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized, reproducible platform for assessing compound effects on neuronal survival, differentiation, and marker expression.
- Operational Value: Enables quantitative immunofluorescence readouts (e.g., calbindin, parvalbumin, sodium channels) for high-content screening applications.
- Scalability: Compatible with multi-well formats and long-term culture up to 21 days in vitro for chronic compound exposure studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Captures embryonic-day-dependent developmental trajectories, allowing modeling of genotype-phenotype correlations in cerebellar disorders.
- Mechanistic De-risking: Supports biomarker alignment via cell-type-specific immunofluorescence (Purkinje, interneuron, granule neuron markers) to validate target engagement.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables evaluation of neuroprotective or neurorestorative candidates through structural and functional maturation metrics.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a biologically relevant system for hypothesis testing and assay validation prior to lead optimization.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and target validation in cerebellar signaling networks using embryonic neuron cultures.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible neuronal cultures with quantifiable morphological and molecular endpoints.
- Analytics: Generates immunofluorescence-based readouts for protein expression, axonal outgrowth, and dendritic arborization to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects embryonic cerebellar development to preclinical models through conserved marker expression and maturation timelines.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable neuronal culture platform applicable across multiple projects targeting neurodevelopmental pathways.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by maintaining neuronal identity and function over weeks in culture, reducing false positives in target validation.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized dissociation, plating, and maturation protocols with defined media changes.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of compound effects on neuronal health and differentiation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of candidates based on effects on cerebellar neuron subtypes and maturation stages.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic tissue dissection, sterile cell culture, and immunofluorescence techniques.
- Depends on access to biosafety cabinets, incubators, centrifuges, and fluorescence microscopes for validation.
- Necessitates standardization of embryonic day selection (E12–E18) and seeding density (500,000 cells/mL) for cross-experiment consistency.
- Involves adaptation considerations when extending protocols to other brain regions or postnatal neuronal subtypes.
- Includes practical limitations such as gradual loss of non-neuronal glial support over time in culture, which may affect neuronal maturation.
