이런 산화물로 hESCs과 hMSCs을 라벨링하는 MR 영상과 생체내 추적 비침습에 대한 Nanoparticles

Dr.Haiku Dal Link의 연구실에 오신 것을 환영합니다. 새로운 줄기세포 치료법 평가를 위한 이 프로젝트에 자금을 지원해 주신 캘리포니아 재생의학회(California Institute of Regenerative Medicine)에 감사드립니다. in vivo에서 주입된 세포를 비침습적으로 추적하는 것이 중요합니다.

이는 MR 이미징 또는 광학 이미징을 위한 특정 또는 다기능 조영제로 in vitro 세포를 라벨링함으로써 가능합니다. 이 동영상은 후속 in vivo 이미징을 위해 인간 중간엽 및 인간 배아 줄기 세포를 라벨링하는 방법을 보여줍니다. 안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 샌프란시스코 캠퍼스 방사선과 분자 및 기능 이미징 센터의 조영제 연구 그룹의 토비아스 헤닝입니다.

오늘은 인간 중간엽 줄기세포와 페리크, 카론, 그리고 펨 옥사이드를 이용한 인간 배아 줄기세포의 체외 라벨링 절차를 보여드리겠습니다. 이 기술은 주입된 세포를 in vivo에 국소화하거나 기능 상태에 대한 정보를 얻는 데 유용합니다. MRI 의식 제제를 사용한 세포 표지 절차는 배아 줄기 세포와 중간엽 줄기 세포에 따라 다르지만, 두 기술 모두 세포 배양 시 부착되는 세포 배양 준비, 줄기 세포의 간단한 배양 트립신에 의한 세포의 배지 표지 및 표지 효율 및 세포 생존력에 대한 자유 의식 물질 평가 평가 등 세포를 도금하는 세포 배양 준비를 포함합니다.

이제 시작하고 일부 셀에 레이블을 지정해 보겠습니다. 이제 Theo Carbatrol로 중간엽 줄기 세포를 라벨링하는 것부터 시작하겠습니다. 먼저 MR 이미징을 위해 테오 카론(theo carron)과 산화철 기반 조영제로 인간 중간엽 줄기세포를 라벨링하는 기술을 보여드리겠습니다.

시작하기 위하여는, 우리는 80%의 합류점에 T 75의 플라스크에 있는 레테르를 붙이는 절차 18-24 시간 전에 세포를 도금합니다그렇지 않으면, 당신이 대략 10, 평방 센티미터 당 000 세포와 동등한 다른 배양 접시를 이용하는 경우에, 우리는 혈청 자유로운 매체의 8 밀리리터에 reservist의 30 마이크로리터를 추가해서 레비테르를 붙이는 매체 준비로 시작합니다. 이것은 80%의 co-fluency에서 하나의 T 75 FLA를 라벨링하고 매체 1밀리리터당 100마이크로그램의 철 농도에 해당합니다. 이제 배양 배지를 제거하고 PBS 또는 무혈청 배지로 세포를 한 번 세척합니다.

우리는 조영제와 결합하고 라벨링 효율성에 영향을 줄 수 있는 잔류 혈청 단백질과 배지의 다른 성분을 제거하기 위해 이 작업을 수행합니다. 라벨링 매체를 플라스크에 추가하고 플라스크를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 2 시간 후 FCS 2ml를 첨가하여 FCS 20 %의 최종 농도를 얻습니다.

우리는 세포가 익숙한 환경에서 죽었다는 것을 구별하기 위한 자극을 받지 않도록 하기 위해 이렇게 합니다. 이제 우리는 18시간 동안 세포를 배양합니다. 다음 날 PBS로 세포를 헹구고 유리 조영제를 제거하기 위해 표준 배양 프로토콜에 따라 기징합니다.

Tryps가 확장되면 400 RCF에서 5분 동안 원심분리하고 PBS에서 reus 현탁액으로 세포 현탁액을 3회 세척합니다. 그거에요. 최종 세포 P는 재현탁될 수 있으며 추가 실험을 할 준비가 됩니다.

이전 세척 단계에서 일부를 잃었을 수 있으므로 지금 세포를 계산합니다. 또한 이 시점에서 트리핀 블루 배제 분석을 사용하여 생존력 테스트를 수행하고 분광 분석을 위해 일부 샘플을 채취하여 라벨링 효율성을 측정합니다. 이제 인간 배아 줄기 세포에 phem oxides를 표시하는 방법을 보여드리겠습니다.

먼저 인간 배아 줄기 세포를 10cm 접시에 플레이트화합니다. 늘 그렇듯이 이러한 접시에는 젤라틴이 미리 코딩되어 있으며 방사선 조사된 공급 세포가 있습니다. 이 프로토콜은 피더 프리 배양에도 사용할 수 있습니다.

우리는 인간 배아 줄기 세포가 약 3-4일 동안 부착하고 성장하여 중간 크기의 군체를 형성하도록 했습니다. 이 기간 동안, 우리는 더 큰 군체는 해체하기가 더 어렵기 때문에 군체가 너무 커지지 않도록 합니다. 나중에 분화된 세포가 이러한 배양물을 오염시킬 수 있습니다.

그래서 군체의 청결도에 따라 해부를 통해 차별화된 문화를 제거해야 할 수도 있습니다. 이제 우리는 100 마이크로그램의 농도, 밀리리터당 철 농도의 테오렘 산화물과 완전한 인간 배아 줄기 세포 배지로 구성된 라벨링 배지를 준비합니다. 이를 위해 89마이크로리터, 펨산화물 및 10밀리리터의 완전 성장 배지를 혼합합니다.

중간엽 줄기 세포의 경우, 죽은 세포나 파편을 제거하기 위해 완전한 배지로 접시를 한 번 씻습니다. 그런 다음 접시당 10ml의 라벨링 배지를 추가하고 4시간 동안 세포를 배양합니다. 이제 라벨링이 완료되었습니다.

다음 단계에서는 세포를 세척하고 단일 세포 현탁액을 얻어야 합니다. 추가 사용을 위해 이를 위해 먼저 접시를 PBS로 헹굽니다. 이제 PBS를 5mL의 0.25% 트립신으로 교체하고 인큐베이터에서 5분 동안 또는 세포가 분리될 때까지 배양합니다.

접시를 자주 두드리는 데 도움이 되며, 이제 세포가 분리되었습니다. 접시에 더 큰 군체가 포함되어 있다면 이러한 덩어리를 제거하기 위해 남은 덩어리일 수 있음을 명심하십시오. 우리는 혈청학적 피펫을 사용하여 위아래로 피펫팅하여 전체 현탁액을 철저히 혼합한 다음 2분 더 그대로 둡니다.

트립신에서. Eppendorf 피펫을 사용하지 않는데, 모든 것이 제대로 작동하면 얇은 팁을 통해 세포를 반복적으로 피펫팅하면 세포막이 파괴될 수 있기 때문입니다. 우리는 현재 배아 줄기 세포 기질과 죽은 세포를 코팅하는 젤라틴에서 비롯된 많은 파편과 혼합된 단일 세포 현탁액을 가지고 있습니다.

이제 40마이크로미터 세포 여과기에 세포를 통과시켜 남아 있는 덩어리 또는 복합체를 제거할 수 있습니다. 이제 우리는 방사선 조사된 영양 세포에서 인간 배아 줄기 세포를 분리해야 합니다. 이것은 젤라틴으로 코팅된 접시에 세포 현탁액을 도금하여 효율적으로 수행할 수 있습니다.

우리가 접시를 조작하지 않는다면, 모든 세포는 침전될 것이지만, 먹이는 인간 배아 줄기 세포보다 더 빨리 부착될 것이다. 따라서 45분 후에 SUP 나틴을 제거하면 주로 인간 배아 줄기 세포가 포함되어야 하고 모이통은 주로 접시에 부착되어야 합니다. 이러한 방식으로 이전 프로토콜과 같이 추가 실험에 사용할 수 있는 자기 표지된 인간 배아 줄기 세포의 단일 세포 현탁액을 얻을 수 있습니다.

이 시점에서는 세포를 계수하고 생존 가능성 평가 및 라벨링 효율성 측정을 위해 샘플을 채취해야 합니다. 이것으로 오늘 보여드리고 싶은 프로토콜이 완성되었습니다. 이제 in vivo에서 표지된 줄기세포를 추적하는 방법을 살펴보겠습니다.

이 슬라이드는 OC Carone 표지 줄기 세포를 보여줍니다. 그들이 쥐의 두뇌로 주사된 후에, 우리는 75 nanoliters의 양에 있는 20, 000의 세포를 중단하고 sub 심실 지역으로 그(것)들을 주사했다. 이식된 세포의 산화철은 MR에서 볼 수 있는 감수성 인공물을 유발합니다. 이미지.

지금까지 배아 줄기 세포와 중간엽 줄기 세포에 라벨을 붙이는 방법을 보여드렸습니다. In vivo에서 중간엽 및 배아 줄기 세포를 추적하는 Mr.Contrast 제제를 사용한 in vitro는 새로운 줄기 세포 치료법을 평가할 수 있는 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다. 그게 다야.

시청해 주셔서 감사드리며 세포 라벨링에 행운을 빕니다.