Trasferimento nucleare in oociti mouse

Biology

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Summary

Questo film e il protocollo hanno lo scopo di aiutare l'apprendimento di trasferimento nucleare.

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Egli, D., Eggan, K. Nuclear Transfer into Mouse Oocytes. J. Vis. Exp. (1), e116, doi:10.3791/116 (2006).

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Abstract

Trasferimento nucleare in un ovocita non fecondato in grado di ripristinare il potenziale di sviluppo di una cellula differenziata. Questo dimostra che i processi alla base dello sviluppo, la differenziazione e l'invecchiamento sono epigenetiche, piuttosto che processi genetici. La reversibilità di questi processi si apre interessanti prospettive nella ricerca di base, e in un futuro più lontano, nella medicina rigenerativa. Nel topo, le cellule staminali embrionali possono essere derivate da embrioni clonati fase preimpianto. Tali cellule staminali embrionali hanno la capacità di dare origine a tutti i tipi di cellule dell'organismo adulto. È importante sottolineare che queste cellule sono geneticamente identiche al donatore. Se applicabile a uomo, ciò permetterebbe la derivazione di cellule staminali da un paziente. Queste cellule potrebbero poi essere differenziate nel tipo di cellula colpita del paziente e studiate in vitro, o utilizzati per sostituire le cellule danneggiate o mancanti. Lo studio del trasferimento nucleare nel topo rimane importante perché ci può diffondere i principi della riprogrammazione nucleare. Questo film e il protocollo di accompagnamento hanno lo scopo di aiutare l'apprendimento trasferimento nucleare nel topo, un metodo sviluppato inizialmente nel gruppo del Prof. Yanagimachi (WAKAYAMA et al. 1998).

Protocol

Preparazioni:

  1. Una descrizione dettagliata di superovulazione e di coltura degli embrioni MicroDrop può essere trovato altrove 2.
  2. Preparare una capsula di Petri con microgocce di medio dell'embrione cultura (ad esempio KSOM, Chemicon). Coprite con olio minerale (olio minerale lotti dovrebbero essere testati per la compatibilità con la cultura degli embrioni). Equilibrare a 37 ° C in aria più il 5% di CO 2. (In Thermo-Electron acqua incubatore 3110 camicia o equivalente)
  3. Preparare un piatto per l'isolamento degli ovociti: gocce Luogo di Hepes tamponata CZB & ialuronidasi (0,1% w / v, Sigma) in una metà del piatto e HCZB nell'altra metà. Coprire con olio minerale. Tenere il piatto caldo su un palco riscaldato di un microscopio a dissezione.
  4. Preparare il microscopio: Inserire una pipetta possesso di un diametro esterno di circa 50 μ m (leggermente più piccolo del diametro del ovocita), e un'apertura di circa 20 m di μ in un titolare pipetta. Pipette holding sono facili da fare con l'attrezzatura necessaria, un ago estrattore (Sutter Instruments) e un microforge (Narishige), ma possono anche essere acquistati presso Humagen.

    Carico 3-5 mercurio l μ nella coda di una micropipetta (diametro interno 8 m μ). Evitare dispersioni di mercurio. Preparare un piatto con varie piccole gocce ciascuno del 11% w / v PVP (polivinilpirrolidone) in HCZB e 5 μ g / ml citocalasina B in HCZB. Utilizzare il coperchio di una capsula di Petri piuttosto che il piatto come il coperchio ha un cerchio breve che non interferisce con il movimento della azienda e delle pipette enucleazione. Allineare la pipetta holding e la pipetta enucleazione di un calo HCZB. Aspirare uno HZCB piccolo nella punta della pipetta holding.
  5. Preparazione delle cellule del donatore dipende in gran parte dal tipo di cellula e l'esperimento il ricercatore intende svolgere. In generale, le cellule del donatore devono essere trattati con un enzima proteolitico come la tripsina e tenuta in ghiaccio per ridurre la viscosità fino al trasferimento.
  6. Umanamente eutanasia topi 14-15 ore dopo la somministrazione di hCG. Ovidotti raccolta e sezionare loro nel warm-HCZB ialuronidasi gocce. Dopo circa. 5 min, gli ovociti saranno per lo più privo di cellule del cumulo. Dovrebbero poi essere lavati più volte in HCZB, poi lavata ulteriormente nella pre-equilibrata gocce KSOM, e tenuti in incubatrice fino enucleazione.

Enucleazione

Manipolazioni sono fatto con micromanipolatori idraulica, (Narishige) su un microscopio invertito, come il TE200 Nikon. Un micromanipolatore piezo (PrimeTech) utilizzate per l'esecuzione la zona pellucida. A punta piatta enucleazione e pipette di trasferimento può essere acquistato da Humagen. Pulire e lubrificare la pipetta enucleazione nelle gocce PVP espellendo microscopiche gocce di mercurio e aspirando ed espellendo PVP. Per evitare che l'ago di vischiosità, la stessa procedura deve essere eseguita tra ogni gruppo di ovociti che sono o enucleato o trasferiti.

Mettere un piccolo gruppo di ovociti nella HCZB-citocalasina goccia B. La dimensione del gruppo dovrebbe essere adattata al livello di esperienza del ricercatore. Ovociti non dovrebbe essere tenuto sul palco per più di 20-30 minuti. Spostare gli strumenti per la HCZB-citocalasina B gocce. La pipetta holding e la pipetta enucleazione devono essere messe in allineamento con il piano equatoriale della ovocita. Questo sarà possibile se la pipetta azienda sia un diametro esterno che è leggermente più piccolo rispetto alla stessa ovocita. Ruotare un ovocita fino a quando il mandrino metafase differente rifrazione può essere visto. Se un principiante non può vedere il mandrino, la piastra di metafase possono essere identificati con il DNA colorante Hoechst e illuminazione UV, tuttavia, che non è compatibile con efficiente lo sviluppo embrionale. Posizionare il mandrino metafase a ore 3 e tenerlo bene con la pipetta in mano. Applicare gli impulsi piezoelettrici a penetrare la zona pellucida. Toccare la piastra in metafase, con la pipetta enucleazione. Una volta che la resistenza del fuso metafase può essere 'sentita', aspirare il mandrino e ritirare l'ago. Il citoplasma dell'ovocita è fluida, il mandrino metafase si muove però come un cespuglio quando è toccato con la pipetta. Cercare di ridurre la quantità di citoplasma che viene rimosso con il mandrino. Dopo che un gruppo di ovociti è stato enucleato, lavarli con la cultura media degli embrioni e metterli in incubatrice fino al trasferimento. Enucleato alcuni ovociti non devono essere trasferiti, ma dovrebbe essere attivato e servire come controllo per l'enucleazione. Questi ovociti si frammenterà entro alcune ore, indicando l'enucleazione di successo.

Trasferimento nucleare

Cellule posto nella soluzione di PVP (11% PVP in HCZB). Se molti cloni arresto a 1-cellula fase, la concentrazione PVP dovrebbe essere abbassata al 5% o meno. Cellule Mescolare bene arguziah PVP. Raccogliere le cellule con una pipetta con un diametro interno leggermente inferiore al diametro della cellula. La membrana della cellula si rompe su aspirazione. In alcuni casi, l'espulsione ripetitivi e aspirazione così come l'applicazione di impulsi piezoelettrici dolce può essere utilizzato per rompere la cellula donatrice. Una nuova goccia di cellule del donatore deve essere effettuato con ogni gruppo di ovociti vengono trasferiti, come cellule del donatore diventare appiccicoso dopo qualche tempo. Iniettare la cellula donatrice rotto poco dopo la rottura della membrana. Per il trasferimento, si concentrano sul piano equatoriale della stessa ovocita piuttosto che il piano equatoriale della zona pellucida, e posizionare il trasferimento e la pipetta tenendo sullo stesso piano. Tenere l'ovocita compresa una parte del suo citoplasma con fermezza. Penetrare nella zona pellucida l'uso di impulsi piezoelettrici. Portare il nucleo donatore alla punta della pipetta, quindi spingere la punta della pipetta quasi al lato opposto della ovocita enucleato, vicino alla pipetta detenzione, facendo un solco profondo nell'ovocita. Aspirare una piccola quantità di citoplasma dell'ovocita nella pipetta, applicare un unico polso debole piezo per rompere la membrana dell'ovocita, espellere il nucleo donatore, ritirare l'ago aspirare rapidamente, mentre a livello della membrana citoplasmatica all'estremità destra del solco. Contemporaneamente estrarre l'ago e aspirazione, dovrebbe essere possibile chiudere il buco lasciato da NT. Questo 'tecnica di rimozione buco ridurrà il numero di ovociti che lyse durante NT. Lavare gli ovociti ricostruito nel KSOM e restituirli al incubatore per 1-3 ore.

Ovocita di attivazione

Preparare la metà di un piatto con goccioline di calcio MCZB libero e l'altra metà con gocce di calcio MCZB libero più 10mM Sr 2 + e 5 μ g / ml citocalasina B per inibire l'estrusione del corpo polare. Equilibrare per 30 min. sotto del 5% di CO 2 in aria. Lavare bene gli embrioni NT di calcio senza MCZB e poi metterli in piccoli gruppi in diverse gocce di calcio senza MCZB. Ritorna il piatto per l'incubatore e la cultura per 5-6 ore. Per il controllo per il protocollo di attivazione artificiale e per le condizioni di coltura degli embrioni, non ovociti enucleati dovrebbe essere usato. Essi si svilupperà come embrioni partenogenetiche. Dopo l'attivazione, lavare gli embrioni attraverso gli embrioni KSOM e posto nell'incubatore a lungo termine cultura. Pronuclei deve essere visibile a questo punto del tempo, che indicano il trasferimento di successo.

Embrione Cultura Media Cookbook

Maestro Sali

Iniziare con 980 ml ​​ultrapura H 2 O in sterili 1 bottiglia L

Aggiungere componenti a secco:

NaCl 4760 mg (81mm) Sigma S-5886
KCl 360 mg (5 mm) Sigma P-5405
MgSO 4 • 7H 2 O 290 mg (1.18mM) Sigma M-2773
KH 2 PO 4 160 mg (1.17mM) Sigma P-5655
EDTA 2NA 40 mg (0,1 mm), Sigma E-6635
Glucosio (D) 1000 mg (5,5 mm) Sigma G-6152

Aggiungi componenti liquidi

Na-lattato (acido lattico) 5,3 ml & nbsp; Sigma 44263
Pen'Strep 10 mL Gibco 15140-122

Per Sali Archivi MCZB:

Filtro sterilizzare 500 sali maestro mL (buon per 3-4 mesi; conservare a 4 ° C)

Per Sali Archivi HCZB:

Iniziare con 500 ml sali maestro

Aggiungere 50 mg di PVA (freddo solubile; Sigma P-8136)

Mescolare per 30-60 min e filtro sterile (buon per 3 mesi; conservare a 4 ° C)

Ca + + libero MCZB (per l'attivazione ovociti in 5% CO 2)

Iniziare con 99 ml di sali magazzino MCZB

Aggiungere componenti a secco:


NaHCO 3 211 mg Sigma S-5761

Na-piruvato (acido piruvico) 3 mg Sigma P-4562

L-Glutamina 15mg Sigma G-8540

Albumina sierica bovina (BSA) 500 mg Sigma A-3311

Agitare fino a quando tutti i componenti sono sciolto; filtro sterile.

HCZB (per micromanipolazione in atmosfera ambiente)

Iniziare con 99 ml di sali magazzino HCZB

Aggiungere componenti a secco:


Hepes-Na 520 mg Sigma H-3784

NaHCO 3 42 mg Sigma S-5761

Aggiungere componenti liquidi:

128 mm CaCl 2 (18.8g / l) 1 ml di Sigma C-7902

Regolare il pH a 7,5 con 1 N HCl

Agitare fino a completa dissoluzione; filtro sterile.

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Discussion

Buona fortuna!

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Acknowledgments

DE desidera ringraziare il Dott. Hide Akutsu per la condivisione dei suoi trucchi NT e il Dr. Stephen Sullivan e Garrett Birkhoff per la lettura critica del protocollo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cytochalastin B Sigma-Aldrich 100x stock = 500 µg/ml Cytochalasin B in DMSO. Store at -20 ˚C.
Strontium Chloride 10x stock = 100 mM SrCl2 in H2O. Store at room temperature.
MCZB Stock Salts Filter sterilize 500 ml master salts (good for 3-4 months; store at 4 ˚C)
HCZB Stock Salts Start with 500 mL master salts. Add 50 mg PVA. Stir for 30-60 min and sterile filter (good for 3 months; store at 4 ˚C).
PVA Sigma-Aldrich P-8136 cold-soluble
HCZB with 11% w/v PVP Start with 20 ml HCZB medium in a 50 ml conical tube. Place 22 g PVP on top of liquid. Close tube and store undisturbed at 4 ˚C for 72 – 96 hr, at which time the PVP will have entered solution. Filter sterilize through an 8 mm filter and store at 4 ˚C.
PVP ICN Biomedicals MW 360,000
Please check for additional buffers compositions in the Protocol part.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eggan, K., Jaenisch, R. Mammalian and Avian Transgenesis- New Approaches. Pease, S., Lois, C. Springer. (2006).
  2. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the mouse embryo. Press, C. S. H. L. (2003).
  3. Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature. 394, 369-374 (1998).

Comments

6 Comments

  1. I am going to start ICSI in Equine (horese) oocyte and for this from start point I have some problems, in papers which I am going to follow they published that before injection they put 1 microlitter of sperm suspension in 3 microlitter of Sp-TALP containing 10% PVP (SIGMA) . I did the same, but you know 10% PVP (I calculated w/v) is to much powder that's why I found all of the sperm dead before injection. I don't know realy how I have to use this PVP (MW 360000) ?!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 5, 2008 - 8:07 AM
  2. Hello - I work at Sigma-Aldrich in St. Louis, Mo. and have received an answer for your question from our technical service group.  It follows below: _____________________________________________________________________________ We really do not have an answer as we do not have an IVF product. We do have the following references however we have not researched them. Some references on this product are as follows: 1. Yamazaki, Y., et al., Reprogramming of primordial germ cells begins before migration into the genital ridge, making these cells inadequate donors for reproductive cloning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100(²1),, 1²²07-1²²1² (²003). ². Shitara, H., et al., Selective and Continuous Elimination of Mitochondria Microinjected Into Mouse Eggs From Spermatids, but Not From Liver Cells, Occurs Throughout Embryogenesis. Genetics, 156, 1²77-1²84 (²000). 3. Coy, J.F., et al., A complex pattern of evolutionary conservation and alternative polyadenylation within the long 3'-untranslated region of the methyl-CpG-binding protein ² gene (MeCP²) suggests a regulatory role in gene expression. Human Mol. Genet., 8(7), 1²53-1²6² (1999). It is commonly used in Denharts solution at 1% (10mg/ml). For mouse embryo culture, PVP 40 (40,000 mw) is used at 0.5% in the culture media. The PVP360,000 solution is used to immobilize or slow the sperm. You may want to use a 1% solution rather than a 10% solution. _____________________________________________________________________________ We hope that the above is helpful to you. - Diane

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 13, 2008 - 4:08 PM
  3. Do clones develop when injected into the body of the mother? ie not in the uterus? perhaps after a sufficient number of cell divisions, growth factors... has anyone tried? a little like conjointed twins. no be immune rejection if it dŒs, this could perhaps then allow to grow new members only, as happens often with conjointed twins. the new members would be fully young.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 29, 2008 - 6:00 PM
  4. terrific, and very instructive. Thanks a lot. Yunhai from China.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 25, 2008 - 3:40 AM


  5. Thanks a lot.

    YongWei from China.

    Reply
    Posted by: yongwei N.
    April 17, 2013 - 5:10 AM
  6. Hello,
    I'm a PhD student form Universitat Autònoma de Barcelona. The main tool of my studies is SCNT. I would like to contact with Dieter Egli and Kevin Eggan if it's possible, because i need some advices about the transfer of electrical impulse through the micropippete.
    Few months ago i used to use PVP 3% for cummulus cells, but i realised that PVP 10% was better for incresase the number of 2 cell embryos. Nowadays the problem is the transmition of piezzo. How much increases the PVP concentration, more difficult is the transmition of the electrical impulse across the micropippete. I've tried to increase the frequency, amplitude and duration of the electrical PiezoDrill, but at the moment is still too much difficult to breack the Zona pellucida.
    I'm sure that you will have some advices or an answer for this problem.
    Thank you.

    Reply
    Posted by: Laia P.
    December 22, 2014 - 1:27 PM

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