Mess-replikative Lebensspanne in der Hefe

Biology

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Summary

In diesem Artikel präsentieren wir ein allgemeines Protokoll zur Messung der replikativen Lebensspanne von Hefe Mutter-Zellen.

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Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast. J. Vis. Exp. (28), e1209, doi:10.3791/1209 (2009).

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Abstract

Altern ist ein degenerativer Prozess durch eine progressive Verschlechterung der zellulären Bestandteile und Organellen aufgrund der Mortalität gekennzeichnet. Die Bierhefe

Protocol

Teil 1: Bereiten Stämme und Platten für replikativen Lebensspanne Analyse

Dieser Abschnitt beschreibt die Herstellung der festen YEPD Platten für den Einsatz in der replikativen Lebensspanne Experiment und die Vorbereitung der Hefezellen für Lebensdauer-Analyse.

  1. Mit geeigneten sterilen Technik vorzubereiten YEPD Agarplatten (1% Hefeextrakt, 2% Bacto-Pepton, 2% Agar, 2% Glucose), die für die Kultivierung Hefezellen und für replikativen Lebensspanne Analyse verwendet werden. Sie sollten mindestens 2 Platten für alle 4-5 Stämme in der Lebensspanne Experiment analysiert werden vorbereitet. Die Platten sollten bereit sein mindestens 2 Tage vor der Lebensdauer Experiment und darf vor Beginn der Lebensdauer Assay trocken. Wenn das Experiment nicht innerhalb von 4-5 Tagen von Gießen der Platten begonnen werden, sollten sie in einem Kühlbrutschrank gelegt und eingewickelt in Parafilm oder Kunststoff zur Austrocknung zu verhindern.
  2. Entfernen Hefestämme aus gefrorenen Beständen und Streifen für einzelne Kolonien auf YEPD Agarplatten. Bis zu 6 Stämme können leicht auf dem gleichen YEPD Platte durch die Aufteilung der Platte in gleich große Kuchen-förmige Keile ausgestrichen werden.
  3. Inkubieren Sie die Zellen bei 30 ° C für 2 Tage.
  4. Remove-Zellen aus dem Inkubator-und Patch-Zellen aus einer einzelnen Kolonie auf eine frische YEPD Platte. Zwei Patches aus zwei verschiedenen Kolonien sollten für jeden Stamm erzeugt werden. Zu diesem Zeitpunkt sollten die Stämme analysiert werden codiert, um sicherzustellen, dass die replikativen Lebensspanne Experiment durchgeführt wird "blind", wo die Dissektoren nicht wissen, die Identität der einzelnen Stämme werden.
  5. Inkubieren Sie die gepatchte, codierte Zellen bei 30 ° C bis zum folgenden Abend.
  6. Entfernen Sie die Zellen und leicht Patch Zellen voneinander kodiert anstrengen, um frische YEPD Platten, die als experimentelle Platten für die replikativen Lebensspanne Analyse dienen soll. Die Zellen sind entlang einer vertikalen Linie auf der linken Seite des YEPD Platte (Abbildung 1) gepatcht werden. Ca. 3-5 Patches pro Platte ist optimal, vorausgesetzt, replikativen Lebensspanne Analyse auf 20 Zellen von jedem Patch. Es ist nicht notwendig (und auch wünschenswert), eine große Anzahl von Zellen, um die frische YEPD Platte zu übertragen, da dies zu den Zellen zu dicht wachsen während der Inkubation über Nacht, die ihre spätere replikativen Lebensspanne begrenzen kann.
  7. Inkubieren Sie die frisch gepatchte Platten über Nacht auf der Tischplatte.

Teil 2: Position Zellen für replikativen Lebensspanne Analyse.

In diesem Abschnitt werden wir beschreiben, wie man die Hefezellen auf der Platte und wie Jungfrau, die Tochter Zellen für replikativen Lebensspanne Analyse zu erhalten Position. Von diesem Zeitpunkt an sollten alle Platten parafilmed, außer wenn unterziehen Dissektion werden, um Austrocknung zu verhindern.

  1. Mit einem Mikroskop mit einer Mikrodissektion geeigneten Vorrichtung für die Hefe ausgestattet, Transfer ca. 50 Zellen, die aus dem ersten Patch anstrengen, um eine Position auf der Platte distal der gepatchten Zellen. Wenn Ihr Mikroskoptisch wird benotet, kann diese Abstufungen verwendet werden, um sicherzustellen, dass die Zellen leicht sein wird im späteren Iterationen zu finden. Auf der Zeiss Axioskop 40, können die Zellen aus dem ersten Patch Belastung an den Koordinaten 90 x 10 platziert und vertikal von dort aufgereiht.
  2. Reinigen Sie die Nadel von Zellen durch wiederholtes Berühren der Agar-Oberfläche, dann erstellen Sie ein Loch in den Agar durch zwingen die Nadel durch die Agar-Oberfläche. Dieses Loch wird als Marker zu orientieren Sie sich auf der Platte dienen bei späteren Iterationen Dissektion und Tochterzelle Entfernung. Achten Sie darauf, Hefezellen in das Loch zu bekommen, oder sie wachsen und bilden eine Kolonie.
  3. Direkt über dem Loch, vertikal auszurichten einzelnen Hefezellen in 20 gleichmäßig verteilten Positionen, mit 1-3 Nadeldurchmesser (~ 100 nM) zwischen jeder Zelle Position (Abbildung 1). Alle paar Zellen, Platz zwei Zellen nebeneinander in der gleichen Position in der Zeile statt einer. Dies ermöglicht eine Redundanz bei Jungfrau, die Tochter Zelle Auswahl, wenn einer der übertragenen Zellen nicht teilen.
  4. Zwischen dem 10. und 11. Positionen in der Linie, eine horizontale Reihe von 7-8 Löcher in den Agar. Dies wird als Marker zu orientieren Sie sich auf der Platte während der nachfolgenden Iterationen der Dissektion und Tochterzelle Entfernung dienen. Achten Sie darauf, Hefezellen in die Löcher zu bekommen, oder sie wachsen und bilden eine Kolonie.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 2,1-2,4 für jeden Patch auf der Platte, weiter zu Array-Zellen vertikal entlang der gleichen Achse. Für Schritt 2,2, sollte die Anzahl der Löcher geschaffen, um die Patch-Nummer (ein Loch für den ersten Patch, zwei Löcher für die zweite, etc.) entsprechen.
  6. Sobald Zellen haben für jeden Patch angeordnet, Parafilm der Platte und inkubieren bei 30 ° C für ca. 2 Stunden.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 2,1-2,6 für jede Platte in das Experiment.

Teil 3: Erhalten Jungfrau, die Tochter Zellen für Lebensdauer-Analyse

In diesem Abschnitt werden wir beginnen die Lebensdauer Analyse, indem sichergestellt wird, dass jede Zelle als eine Jungfrau, die Tochter beginntZelle.

  1. Entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator und sicherstellen, dass die meisten der angeordneten Zellen haben eine Zellteilung durchlaufen. Wenn zusätzliche Zeit benötigt wird, damit die Zellteilung abgeschlossen ist, geben Sie die Platte in den Inkubator.
  2. Beginnend mit dem ersten angeordnet Zelle, verwenden Sie die Nadel auf Tochterzellen aus der Mutterzelle durch sanftes Auflegen der Nadel auf der Oberseite des anhaftenden Zellen zu lösen. Manchmal ist es hilfreich zur Seite des Mikroskops Basis klopfen, während die Nadel auf die Zellen ruht.
  3. Legen Sie die freistehende Tochterzelle in die vertikale Linie, anstelle der Mutterzelle und alle weiteren Tochterzellen und bewegte sie vorübergehend beiseite.
  4. Wiederholen Sie Schritt 3,2 und 3,3 für jedes der angeordneten Zellen. Wenn eine Zelle nicht teilen, nehmen Sie eine Tochterzelle aus einer der redundanten Zellen in Schritt 2.3 positioniert. Wenn Sie fertig sind, sollten Sie verfügen über 20 Tochter-Zellen für jeden Patch vertikal auf die Lebensdauer Platte ausgerichtet.
  5. Sammeln Sie alle der Mutter-Zellen und extra Tochterzellen in einen Haufen und übertragen Sie sie zurück in ein Gebiet in der Nähe des Patches ("Friedhof"). Es ist wichtig, um unerwünschte Zellen weit von den Zellen, die eine Lebensdauer-Analyse zur Bildung von Mikrokolonien und die Erschöpfung der lokalen Nährstoffen verhindern zu halten.
  6. Parafilm der Platte und inkubieren bei 30 ° C für ca. 2 Stunden.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 3,2-3,6 für jede Platte in das Experiment.

Teil 4: Messung der replikativen Kapazität der einzelnen Zellen

  1. Bereiten Sie die Lebensdauer Datenblättern. Eine Lebensdauer Datenblatt kann ein einfaches Gitter, wobei jede Zeile entspricht einer einzelnen Mutterzelle und jede Spalte entspricht einem Alter-Punkt (Abbildung 2). Beschriften Sie jedes Datenblatt nach der Zahl der Stämme analysiert werden.
  2. Entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator und sicherstellen, dass die meisten der angeordneten Zellen haben mindestens eine Zellteilung durchlaufen. Wenn zusätzliche Zeit benötigt wird, damit die Zellteilung abgeschlossen ist, geben Sie die Platte in den Inkubator.
  3. Beginnend mit dem ersten angeordnet Zelle auf der ersten Platte, visuell zu beobachten Mutter und Tochter Zelle (n) und bestimmen Sie die Anzahl der Zellteilungen, die aufgetreten sind. Es ist im Allgemeinen leicht zu bestimmen, wie viele Tochterzellen eine Mutter produziert hat, basierend auf charakteristische Muster von Zell-Arrangements. Notieren Sie die Anzahl der Tochterzellen von der Mutterzelle in das entsprechende Feld auf die Lebensdauer Notenblatt produziert.
  4. Verwenden Sie die Nadel auf Tochterzellen aus der Mutterzelle, wie in Schritt 3.2 beschrieben zu lösen.
  5. Bewahren Sie die Mutterzelle in seiner Position in der vertikalen Linie und bewegen Sie die Tochter Zelle (n) vorübergehend beiseite.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 4,3-4,5 für jede der Zellen angeordnet.
  7. Sammle alle verworfen Tochterzellen und verschieben Sie sie in den "Friedhof", in der Nähe des ursprünglichen Patches entfernt.
  8. Parafilm der Platte und inkubieren bei 30 ° C für 2-3 Stunden.
  9. Wiederholen Sie die Schritte 4,3-4,8 für jede Platte in das Experiment.
  10. Wiederholen Sie die Schritte 4,2-4,9, bis alle Mutter-Zellen aufgehört haben sich zu teilen. Als die Mutter Zellen altern, wird der Zellzyklus langsamer und wird es wünschenswert sein, um die Platte für längere Zeit zwischen Alter-Punkte inkubieren. Die Platten können bei 4 ° C über Nacht gelegt werden.

Teil 5: Repräsentative Ergebnisse.

Die Rohdaten von einem replikativen Lebensspanne Experiment erzeugt wird, eine Liste Zahlen entsprechend Tochterzellen durch jede Mutter Zelle in jedem Alter-Punkt (Abbildung 2) produziert. Durch Summierung jeder Zeile der Spielberichtsbogen ist der replikativen Lebensspanne für jede Mutterzelle erhalten. Die Daten für Mutter-Zellen aus den gleichen experimentellen Gruppe gepoolt, um ein Überleben Kurve (Abbildung 3A) zu erzeugen und statistische Berechnungen, wie zB mittlere Lebensdauer, mittlere Lebensdauer und die Standardabweichung durchzuführen. Ein nicht-parametrischen Test, wie der Wilcoxon Rank-Sum-Test durchgeführt um festzustellen, ob signifikante Unterschiede in Lebensdauer zwischen experimentellen Gruppen wurden erkannt werden. Wenn das Experiment richtig funktioniert, sollte das Überleben Kurve in etwa im Einklang mit Gompertz-Makeham Kinetik zeigt eine sigmoide shap mit niedrigen Frühletalität folgte eine relativ raschen Rückgang der Überlebensrate und eine Abflachung der Kurve zu einem späteren Alter. Die meisten Wildtyp-Stämme haben replikativen Lebensspanne Werte in der 20-30 Generation Bereich, obwohl Variation außerhalb dieses Bereichs berichtet worden ist.

Abbildung 1
Abbildung 1.5
Abbildung 1. Schematische Darstellung eines typischen replikativen Lebensspanne Platte. Am Abend vor Beginn Mikrodissektion von Hefezellen, sind 3-5 Stämme leicht auf die Oberfläche eines YEPD Platte (rote Kästen) in einer vertikalen Linie entlang einer Seite der Platte gepatcht. Nach Wachstum über Nacht, sind etwa 30 einzelnen Zellen jedes Stammes vertikal in eine Linie mit 20 Positionen bekleidet. Lebensdauer analysis wird auf v Jungfrau, die Tochter Zellen aus diesen ersten erhaltenen Zellen durchgeführt werden. Extra-Zellen aus Mikrodissektion während des Experiments (zB unerwünschte Tochter-Zellen) gewonnen werden in "The Graveyard" (graues Oval), die weit weg von der experimentellen Zellen befindet, um die lokalen Erschöpfung der Nährstoffe als Kolonien gebildet sind, zu vermeiden platziert.

Abbildung 2
Abbildung 2. Ein replikativen Lebensspanne Strichliste. Raw Daten aus einer replikativen Lebensspanne Experiment ist gezeigt. Jede Zeile entspricht einem Hefe Mutterzelle und jede Spalte entspricht einem Alter-Punkt. Die Zahl in jedem Feld eingegeben wird, die Zahl der Tochterzellen durch die Mutterzelle in diesem Alter-Punkt produziert. Jeder Stamm ist mit einer codierten Zahl, so dass die einzelnen seziert die Hefezellen keine Kenntnis von der Identität der Stämme, die analysiert wurde beschriftet. Twenty-Zellen sind für jeden Stamm untersucht.

Abbildung 3
Abbildung 3. Vertreter Überleben und Wachstum Kurven aus einer replikativen Lebensspanne Experiment. (A) Überlebenskurven sind durch Auftragen der Anteil der Mutter-Zellen noch am Leben, als eine Funktion der replikativen Alter (Anzahl der Zellteilungen. (B) erhaltenen Wachstumskurven werden durch Auftragen der erhaltenen durchschnittliche Zahl der Tochterzellen von einer bestimmten Dehnung als Funktion des Alters-Punkt erzeugt. In diesem Beispiel ist der Stamm Nr. 2 langlebiger ist aber langsamer wachsen, als durch die reduzierte anfängliche Steigung der Wachstum Grundstück belegt.

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Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss zu MK und BKK von der Ellison Medical Foundation unterstützt. MK ist eine Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging. Wir möchten Soumya Kotireddy für die Unterstützung danken, während der Dreharbeiten.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Agar Reagent Fisher Scientific DF0145-17-0 (214530)
Bacto-Peptone Reagent Fisher Scientific DF0118-17-0 (211677)
Yeast Extract Reagent Fisher Scientific DF0886-17-0 (288620)
Glucose

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References

  1. Kaeberlein, M., Burtner, C. R., Kennedy, B. K. Recent developments in yeast aging. PLoS Genet. 3, (2007).
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