מה שחשוב לדעת: Stereology משוחדת במוח שאינם האדם הפרימאטים

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

הארגון האנטומי של המוח הפרימטים יכול לספק תובנות חשובות בתנאים נורמליים ופתולוגיים אצל בני אדם. Stereology משוחדת היא שיטה מדויקת ויעילה לאמוד את מספר נוירון הכולל (או סוג תא אחר) בחלל התייחסות נתונה

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Burke, M., Zangenehpour, S., Mouton, P. R., Ptito, M. Knowing What Counts: Unbiased Stereology in the Non-human Primate Brain. J. Vis. Exp. (27), e1262, doi:10.3791/1262 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

פרימטים שאינם בני אדם היא מין translational חשובים להבנת תפקוד נורמלי ומחלות תהליכים של המוח האנושי. Stereology משוחדת, השיטה המקובלת המדינה-of-the-art עבור כימות של אובייקטים ביולוגיים בסעיפים רקמה

Protocol

חלק 1: טרום עיבוד של רקמות צריך להיעשות לפי בורק et al. (2009) 5.

  1. בקצרה, רקמה יש perfused היטב עם paraformaldehyde, glutaraldehyde, או פורמלין. זו יכולה להיות מושגת באמצעות זלוף transcardial הסטנדרטית המשמשת בדרך כלל כדי לקצור איברים אחרים. במחקר הנוכחי הנושא היה מורדמת עם קטמין הידרוכלוריד (10 מ"ג / ק"ג, IM), מורדמים עם ממנת יתר של pentobarbital נתרן (25 מ"ג / ק"ג, ד) ו perfused transcardially עם 0.1 מ PBS עד exsanguinated לחלוטין. זה ואחריו פתרון paraformaldehyde 4% PBS דקות 5 (~ 1 ליטר). רקמות צריך להיות perfused היטב עם paraformaldeyhde, gluteraldehyde, או פורמלין. המוח צריך להיות חסום stereotaxically, להסיר הגולגולת, שקל, נפח נחוש, cryoprotected, קפואים 5.

חלק 2: דגימה שיטתית של רקמות, על פי ברק ואח'. (2009) 6.

  1. בדוגמה זו אנו מתמקדים האונה הקדמית של המוח vervet. מרחב ההתייחסות הוגדרה לכלול רקמת קליפת המוח של מענית המרכזי המוט הקדמי של האונה השמאלית. לענייננו הסדרה נקבעו ב 1 / 10 חלקים בכל קליפת המוח, נחתכה ב 50μm. סדרה אחת שלמה היה מוכתם סגול cresyl (סדרה מס '1). סדרה 2 היה מפוצל כך ממחצית הקטעים היו מוכתמות כלוריד זהב התגלות המיאלין ואת החצי השני מוכתם עבור esterase אצטילכולין (לקביעת אזורים קורטיקליים מסוימים). סדרה כל האחרים היו הפקידה ב לשמר אנטיגן במסגרת תוכניות לטווח ארוך המחקר שלנו.

חלק 3: Stereology (לפרטים נוספים, ראה מוטון 2002) 4

  1. הערכה הכוללת של מספרים סלולריים (N) מחושב על בסיס המשוואה הבאה:
    N = ssf -1 asf x -1 x TSF -1 x Σ ש -
    איפה ssf הוא שבר הדגימה סעיף, ASF היא הדגימה אזור השבר, TSF אם הדגימה עובי חלק (שם נמדד עובי של רקמת מחולק בגובה מבתר), ו Σ ש - הוא המספר הכולל של אובייקטים עניין ספרתי בתוך מבתר. הסעיפים הבאים של פרוטוקול זה להראות כיצד לקבוע את ssf, ASF, TSF ו Σ ש.
  2. שבר דגימה סעיף (המחשב לא מבוסס)
    1. מרחב ההתייחסות כולה חייבת להיות מוגדרת היטב מן הקדמי אל האחורי ואת הגב אל הגחון. בדוגמה זו אנו מעוניינים האונה הפרונטלית ואת הגדירו אותו באזור מקצה המוט הקדמי (anterior) ועד מענית המרכזי (האחורי) ואת מענית לרוחב (הגחוני) ללא שיתוף האינסולה.
    2. עבור האונה הקדמית של הנושא המסוים הזה כולל סעיפים 760 נאספו באופן שיטתי עם מוכתם 76 עבור סגול cresyl. מאז המטרה היתה 10 חלקים בחלל התייחסות 1 / 6 חלקים סגול cresyl מוכתם נדגמו, המוביל חלק מדור מדגם של כ - 1 / 60. אנחנו אקראי התחיל עם אחד הראשונים 6 סעיפים מוכתם cresyl סגול שנדגמו באופן שיטתי 1 / 6 ואילך. סך של 13 חלקים נדגמו לנושא הנבחר (איור 2).

  3. לדוגמא שבר שטח (מבוססות מחשב)
    1. מחקר פיילוט יציין את גודל רשת אופטימליים, שבר דגימה שטח, כדי לטעום את מרחב ההתייחסות עם כ 100-300 disectors. בתוך האונה הפרונטלית, גודל רשת של 2 מיקרומטר 2500 הניבו בממוצע 254 disectors עבור נושא זה (איור 2). גודל disector צריך התשואות בין 0-5 על אובייקטים ספרתי, במקרה הזה, הנוירונים.
  4. לדוגמא שבר עובי (מבוססות מחשב)
    1. במיקום כל disector, בעיצומה של הרקמה נמדדת, וחלק של גובה זה שנדגמו; זה נקרא שבר הדגימה עובי. כדי לקבוע את עובי שנמדד, להתמקד באמצעות מטוס-z עד התא הראשון מתחדד, ולאחר מכן לגבות מעט לחלק העליון של הסעיף, כלומר, עד העצם האחרונה נראה פשוט מחוץ לפוקוס. כדי לקבוע את החלק התחתון של הרקמה, להתמקד באמצעות מטוס-z עד התאים הם בקושי מחוץ לפוקוס.
    2. התמקדות באמצעות מטוס-z, התאים צריכים להיות מוכתם בעומק כל, אם לא, זה יכול להצביע על חדירה חלקית של התייבשות את הכתם או לא אחידה של רקמות, ובמקרה הסעיפים צריך להיות מחדש מוכתם. זהירות זה חשוב במיוחד עבור רקמות immunostained הדורש חדירה של immunoprobes באמצעות סעיפים רקמה עבה יחסית. מסיבה זו, רקמה immunostained צריך להיות counterstained קלות עם סגול basophilic כתם (למשל cresyl, המהtoxylin) כדי לקבוע במדויק העליון והתחתון של הסעיף וכדי לאשר חדירה של הנוגדן. במחקר זה הסעיפים היו פרוסים בכל הגדרה microtome של 50μm. אחרי הכל עיבוד רקמות הושלם, עובי רקמת נמדד בממוצע 17.9μm (איור 2), עם הצטמקות ממוצע של כ - 65%. שים לב כי תוצאות אלו מייצגות הצטמקות טיפוסי רקמות מעובד להכנת היסטולוגית שגרתי 7.
    3. Disector גובה ברירת המחדל עבור המחקר הטיפוסי הוא 10μm. ההבדל בין גובה disector ואת עובי סעיף הנמדד הוא גובה השומר, כלומר את נפח הרקמה שבה אין תכונות ביולוגיות נספרים. השימוש גובה שומר נמנע נזק לרקמות על משטחים חתך (למשל, איבד כמוסות).
  5. המספר הכולל של אובייקטים ספרתי, Σ ש -
    1. כדי למנוע הטיה של טעויות זיהוי, קיים הכרח כי הגדרה הסטנדרטי הוא במעקב במשך תכונה ביולוגית מסוימת של עניין. במקרה זה, היינו מעוניינים לספור נוירונים. לכן, נוירון הוגדר כבעל nucleolus במיקום מרכזי הנראה הציטופלסמה מוגדרים בבירור, בעוד תאים גליה בדרך כלל חסר nucleoli גלוי בציטופלסמה. לגבי הנושא הזה 457 נוירונים נספרו.

חלק 4: Stereologer - מערכת ממוחשבת Stereology (Stereology מרכז משאבים, צ'סטר, MD)

  1. מערכת Stereologer מנחה את המשתמש למלא את המידע הדרוש בצורה צעד אחר צעד. במקטע "מידע מחקר" הפרמטרים של המחקר מבוססים. מאז מרחב ההתייחסות חייבת להיות מוגדרת עבור המחקר, הפרמטר נפח יש לבחור (עבור מרחב ההתייחסות הערכת Cavalieri יש לבחור). נפח אובייקט יכול להיות גם שנבחר כאן כדי להעריך את מספר משוקלל נפח לאוכלוסייה של אובייקטים של עניין. לדוגמה שלנו, רק נפח החלל התייחסות נבחר. עבור כל אובייקט, בחר את מספר ולהגדיר את התכונה של עניין, במקרה זה נוירונים.
  2. אתחול מקרה: בסעיף זה את המידע הדגימה היא הוקמה. הזן את מרווח הדגימה לוח (אם לוחות נפרדים של רקמת היו פרוסים ממצה בכל סעיף ממוקם בסדר רציף מכן הזן 1 כאן). הזן את המספר הכולל של החלקים שצולמו בחלל הייחוס (במקרה זה 760). לאחר מכן, הזן הדגימה סעיף רווח (במקרה זה 59). לאחר מכן, המערכת מחשבת את מספר סעיפים להיות שנדגמו (במקרה זה 13).
  3. פרמטרים Probe: סעיף זה מגדיר את הרשת ואת גודל disector. לקבלת נפח, להשתמש בהגדלה נמוכה 2.5x-10x להגדיר את המרווח רשת תחת תפריט עריכה. הגדלה אובייקט צריכה להתבצע בכל 100x (NA 1.3 או 1.4). אזור פריים הוא בגודל של disector, במקרה הזה השתמשנו מסך 50%. גובה המסגרת עובי של disector; להגדיר 10μm כאן. המרווח מסגרת בגודל של הרשת. במחקר הפיילוט שלנו מצאנו כי 2500μm התשואות בין 150-200 מסגרות במרווחים באופן שיטתי אחיד בחלל התייחסות גדול יחסית. עבור אזורים קטנים, גודל רשת קטן אמור לשמש. מחקר פיילוט יזהה את הפרמטרים בדיקה אופטית לחקר ומקרה.
  4. לאחר הפרמטרים המחקר הוקמו, דגימה דרך רקמות יכול להמשיך. התוכנית תנחה אותך המדגם החלק הראשון שלב 1:. התוכנית תנחה את המשתמש, בהגדלה נמוכה, כדי להתחקות אחר מקום התייחסות בקטע. המערכת אז במקום לרשת על הקטע מבוסס על פרמטרים בדיקה המשתמש אז יהיה לאמת נקודות ליפול בתוך המרחב התייחסות. אם הנקודה היא לא בתוך מרחב ההתייחסות פשוט לחץ על הנקודה ולא יחושב לתוך נפח שלב 2:. המערכת במקום רשת חדשה על המרחב התייחסות, המבוססת על פרמטרים ריווח המסגרת. ודא כי בצמתים נפילת בתוך המרחב התייחסות שלב 3:. המערכת תנחה את המשתמש כדי לעבור אובייקטיבי את ההגדלה גבוה ולעבור את הבמה מבתר הראשונה שלב 4:. בשלב זה המערכת מציגה למשתמש להגדיר את העליון והתחתון של הסעיף אז המערכת מגדירה את מרחב הדגימה שלב Z-ציר 5:. המשתמש יהיה ולאחר מכן לחץ על כל אובייקט זה נופל בתוך disector באמצעות מטוס-z. אובייקטים לגעת קווים אדומים או התחתון של disector לא יכול לסמוך. לאחר כל אובייקט נספר, לחץ על הבא. השלב יעברו disector הבא שלבים 4 ו -5 יחזור על עצמו. לאחר כל disectors עבור המקטע נספרו, המערכת מהמשתמש להכניס את סעיף רציפים ליד להיות נחקר. שלבים 1-5 יחזור על עצמו עד שכל הסעיפים רציפים ישכבר שנדגמו. המערכת תאפשר ולאחר מכן לספק את החישובים ASF, ssf, TSF, ו Σ ש. בהתבסס על פרמטרים אלה, המערכת תפיק N מוערך, נפח התייחסות לספירה של מספר הן בהיקף מוערך. זה יהיה גם לתת המלצות להתייעל או לצמצם את לסה"נ (איור 2).

חלק 5: תוצאות נציג:

Stereology משוחדת מספק הערכות יעיל ואמין של אוכלוסיות תאים בתוך מרחב התייחסות. ישנם מספר של מערכות מבוססות מחשב stereological זמין, אשר כולם מסתמכים על דגימה שיטתית מרחב התייחסות מוגדרת. השתמשנו במערכת BioQuant מדעי החיים להעריך את האוכלוסייה הכוללת של נוירונים בקליפת המוח של 2 בן vervets להיות מעל 828 מיליונים (איור 3) עם ממוצע של 0.042 לספירה. יש לנו לאחר מכן נעשה שימוש במערכת Stereologer להעריך כי חשבונות באונה הפרונטלית למספר כמחצית נוירונים בקליפת המוח 8.

דמות 1
איור 1 המחשב מבוסס Stereology מערכות. הגדרת היסוד של מערכות stereology זהה, מיקרוסקופ עם הבמה ממונע (xyz), בקר הבמה, מצלמת וידאו, מחשב, תוכנה. המערכת אשר נבחרה בסופו של דבר צריכה להיות מבוססת על יעילות, הצרכים, ניתוח עלות.

לימוד מידע
שם המחקר קורטקס פרונטלי
החוקר הראשי MB
מין AG
הפניה שטח פרונטלי Cortex
הערות
CASE מידע
נתונים אספן MB
תאריך יום רביעי, 30 אפריל, 2008
קבוצה שליטה
נושא O26
הערות
דגימה מאפיינים
לוח מרווח דגימה 1
סה"כ מדורים 760
סעיף מרווח דגימה 59
החל מדור 2
שברים
ASF .0002
SlabSF 1.0000
SSF .0169
TSF .5587
תוצאות תקציר
פרמטר בדיקה שם תוצאה CE SD
עובי --- --- 17.8996 μ --- ---
מספר Disector נוירון 243833769.1473 .0474 N / A
נפח Cavalieri פוינט גריד נפח 1719769397954.1284 μ ^ 3 .0078 N / A
המלצות
בדיקה אובייקט מספר (נוירון)
CE .0474
המלצות CE מקובל.
מספר Disectors נצפה גבוה מדי, הגדל ריווח Disector.
בדיקה אזור Volume (נפח)
CE .0078
המלצות CE מקובל.
חלק מהתוצאות
סעיף נוירון נוירון NumObjects NumCorners נפח RegPoints
1. 40 48 34
2. 26 52 44
3. 29 56 48
4. 39 100 83
5. 49 112 83
6. 53 156 120
7. 65 128 106
8. 45 108 100
9. 52 100 77
10. 26 64 60
11. 21 44 44
12. 11 36 32
13. 1 12 6

איור 2 תוצאות מהאונה Fontal שהושגו עם מערכת Stereologer. עבור האונה הפרונטלית, החלק הארוך של תהליך stereological היה דגימה שיטתית חתך. מעריכים, טופוגרפיה נפח העצבית הושלמו ביום כ לכל נושא. האונה השמאלית נדגמה ומספר כפול בטקסט אומדן משוער של שתי ההמיספירות.

דמות 3
איור 3 אומדן אוכלוסייה Cortex העצבית שהושגו עם BioQuant. מערכת BioQuant דורש הטופוגרפיה המדויקת לפני הספירה התא. הנה ממוצע של 13 חלקים נדגמו. הטופוגרפיה קליפתיים ואמידת נפח שלאחר מכן לקח בין 15-20 שעות לכל נושא. טופוגרפיה בוצעה תחת מטרה 2.5x והספירה נעשה באמצעות שמן 100x טבילה אובייקטיבי (NA 1.3). כל סעיף 100 נבחר ברחבי האונה השמאלית עם ממוצע של 180 disectors שנדגמו. לאחר הטופוגרפיה הושלמה ספירת העצבית לקח בערך יום. האונה השמאלית נדגמה ומספר כפול בטקסט אומדן משוער של שתי ההמיספירות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Stereology משוחדת במוח קוף דומה לזה של דגימות ביולוגיות אחרות. עם זאת, בהתחשב בגודל של המוח הפרימטים, תוכנית עיבוד זהיר מומלץ מאז חצי כדור יחיד של הקוף vervet תשואות יותר מ 1200 חלקים כאשר פרוס על 50μm. ראשית אנו ממליצים stereotaxically חוסמים את המוח לגושים 1cm, המספק מטוס סטנדרטי סעיף בין בלוקים נושאים, ממזער סעיפים חלקית בין הבלוקים, ומספק בלוקים בגודל לניהול 5. צעד חיוני stereology היא דגימה שיטתית כזו 6-10 חלקים מתקבלים דרך השטח התייחסות. עבור המוח הפרימטים, זה משאיר כמות משמעותית של חומר לא מעובד, זאת על מנת למקסם את הפוטנציאל נתונים המתקבלים במוח אחד אנו מציעים הבנקאות רקמות אנטיגן לשמור על תוכניות ארוכות טווח המחקר 6. כאשר רקמה היא הפקידה, גישה immunodetection שיטתית לזיהוי חלבונים היעד במוח קוף יכול להיות מוכן stereology 9. אזורים גדולים יותר כגון קליפת המוח או האונות עשויים לדרוש סעיפים 10-14, אז לפני חתך תוכנית צריך להיעשות כדי להיות לפחות 10 סעיפים בחלל הקטן התייחסות לעניין פוטנציאליים. מחקר פיילוט צריך גם להתבצע על נושא הבקרה כדי להגדיר את הפרמטרים עבור המחקר stereological. יתר על כן, כאשר מציגים או לפרש נתונים stereological פרסם ASF, TSF, ssf, ו Σ ש יש לדווח יחד עם הערכים המתאימים לספירה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות Ikiel Ptito לקבלת תמיכה טכנית המשיכה שלו. NSERC להעניק MP.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereologer Stereology Resource Center (Chester, MD) www.disector.com
Stereology Tool-Kit Stereologer system BioQuant Life Sciences (Nashville, TN)
StereoInvestigator MBF Bioscience

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Aat Rec. 231, 482-497 (1991).
  2. Saper, C. B. Any way you cut it: a new journal policy for the use of unbiased counting methods. J Comp Neurol. 364, 5-5 (1996).
  3. Sterio, D. C. The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector. J Microsc. 134, 127-136 (1984).
  4. Mouton, P. R. Principles and Practices of Unbiased Stereology. The Johns Hopkins University Press. Baltimore. (2002).
  5. Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Dissecting the non-human primate brain in stereotaxic space. J Vis Exp. 29, (2009).
  6. Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Brain banking: Making the most of your research. J Vis Exp. 29, (2009).
  7. Manaye, K. F., Wang, P., O'Neil, J., Huafu, S., Tizabi, Y., Thompson, N., Ottinger, M. A., Ingram, D. K., Mouton, P. R. Neuropathological Quantification Of Dtg APP/PS1: Neuroimaging, Stereology, And Biochemistry. AGE. 29, 87-96 (2009).
  8. Burke, M. W., Palmour, R. M., Ervin, F. R., Ptito, M. Neuronal reduction in frontal cortex of primates after prenatal alcohol exposure. Neuroreport. 20, 13-17 (2009).
  9. Zangenehpour, S., Burke, M. W., Chaudhuri, A., Ptito, M. Batch immunostaining for large-scale protein detection in the whole monkey brain. J Vis Exp. 29, (2009).

Comments

2 Comments

  1. Hi there,
    If i understood correctly, you quantified the number of neurons in the frontal cortex of the verbet monkey and you got ²43 million neurons in a volume of 17²0 mm^3. That renders a density of 14²000 neurons / mm^3. Is not that way too much? higher than mice....

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 24, 2011 - 7:26 PM
  2. Can someone repair this video?? It won't load after the first few seconds of the introduction. My internet connection is great. The video gives an error message. Thank you

    Reply
    Posted by: Amanda M.
    June 2, 2013 - 8:16 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics