אצווה Immunostaining לגילוי בקנה מידה גדול חלבון הנמצא במוח הקופים שלמים

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

בקנה מידה גדול immunodetection של חלבונים יעד ברחבי המוח הפרימטים כולו ניתן על ידי העסקת רקמה רומן הטבעה וכן חתך שיטות בשילוב עם השימוש במנגנון יצירתיים מכתים אצווה של ריחוף ללא מקטעים מרובים בכל זמן נתון.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Zangenehpour, S., Burke, M. W., Chaudhuri, A., Ptito, M. Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain. J. Vis. Exp. (29), e1286, doi:10.3791/1286 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

אימונוהיסטוכימיה (IHC) הוא אחד טכניקות מעבדה הנפוצה ביותר לצורך זיהוי של חלבונים היעד

Protocol

Immunohistochemisty היא אחת הטכניקות הנפוצה ביותר לאפיון ביטוי חלבון במוח של שונות במודלים של בעלי חיים ניסיוניים. קל יחסית לנהל הליכים immunohistochemical שיטתי על מוחותיהם של מכרסמים אחרים מודלים ניסיוניים משותף עם מוח בגודל דומה. עם זאת, אין עבודה שפורסם לידע שלנו המספק תיאור מקיף של איך לבצע את ההליכים immunodetection כאלה ברחבי מוח קוף כולו. להלן תיאור מפורט של איך להכין מוח קוף כולו לגילוי בקנה מידה גדול immunohistochemical של חלבונים היעד השונים. עבודה זו התפתחה כתוצאה של שיתוף פעולה בין יוזמות מסחריות אקדמי. ככזה, פרטים הנוגעים רקמות הטבעה וכן חתך להישאר ידע קנייני של NSA.

חלק 1: טיפול בבעלי חיים והכנה רקמה

המוח של קוף vervet מבוגר (Cercopithecus aethiops) משמש פרוטוקול הנוכחי. כל ההליכים מתבצעים בהתאם המועצה הקנדית על בריאות בעלי חיים (CCAC) הנחיות שימוש וטיפול בבעלי חיים במחקר ביו 1.

  1. בעלי חיים היא מורדמת עם קטמין הידרוכלוריד (10 מ"ג / ק"ג, IM), מורדמים עם ממנת יתר של pentobarbital נתרן (25 מ"ג / ק"ג, ד) ו perfused transcardially עם 0.1 מ PBS עד exsanguinated לחלוטין.
  2. זה ואחריו פתרון paraformaldehyde 4% PBS דקות 5 (~ 1 ליטר).
  3. המוח מוחצן ממוקם PBS שנאגרו פתרונות מדורגים סוכרוז (10, 20 ו ברצף, 30%) המכיל נתרן אזיד 0.02% ומתוחזק ב -4 ˚ C עד המוח שוקע לתחתית המיכל. הפתרון הוא להחליף כל כמה ימים עד שהמוח עובר להקפיא חתך.
  4. המוח הוא נשלח Neuroscience Associates (NSA; Knoxville, TN) להיות נתון MultiBrain הקניינית שלהם ™ הטבעה ולהקפיא-חתך הטכנולוגיה.
  5. שבע (7) ציוני דרך יישור ממוקמים המטריצה ​​הטבעה כך ניתן לזהות קטעים אוריינטציה כראוי (כלומר, משמאל לימין כיוון) מחדש בציר לאחר עיבוד היסטולוגית תושלם.
  6. הבלוק קפוא מצולמת דיגיטלית בפניו לחסום לפני כל קטע סדרתי הוא שנאספו ברחוב. תמונות דיגיטליות, כמו גם חלקים מהמוח זה יכול להיות מאוחר יותר נעשה שימוש לשיקום 3D של מפות אנטומית היסטולוגית, בהתאמה.
  7. סידורי חופשי צף סעיפים העטרה, על עובי של 50 מיקרומטר לכל סעיף, נאספים מן המוח כולו.

חלק 2: עיבוד היסטולוגית

קטעים נבחרים במרווח מרחבי נתון (למשל, 500 מיקרומטר) ולמטרות הניסוי שלנו עובדו עם נוגדנים הבאים:-X השביר חלבון פיגור שכלי (FMRP; Chemicon: Temecula, CA), SMI32 (Sternberger Monoclonals Inc; בולטימור, MD), ו NeuN (Chemicon: Temecula, CA). FMRP הוא חלבון cytoplasmic כי מצאו בשפע בנוירונים של המוח המוביל נורמלי תמורה 2. NeuN (גרעינים עצבי) דווקא מזהה את ה-DNA מחייבת נוירון ספציפי NeuN חלבון אשר שוהה רוב הנוירונים מופץ גרעינים העצבית, perikarya וכמה תהליכים עצביים הפרוקסימלי 3. SMI-32 היא נוגדן חד שבטי המכירה epitope הלא פוספורילציה על חלבונים neurofilament 4.

  1. בהפרש של 500 מיקרומטר, כ 140 חלקים המשמשים לכל נוגדן.
  2. Incubations הכל, תחליבי צעדים מכתים מתבצעות עם תסיסה קלה באמצעות כלים מיוחדים מכתים וסלים (HistoTools; Knoxville, TN).
  3. מדורים מודגרת הראשון בתמיסה המכילה 0.1 M טריטון PBS/0.3% X-100 (TX) / 5% נסיוב צרוד רגילה (NHS) במשך 60 דקות על מנת לצמצם מחייב ספציפי של מולקולות נוגדן ו מכתים רקע וכתוצאה מכך.
  4. סעיפים המסומנים FMRP immunostaining לעבור שלב נוסף של התאוששות אנטיגן באמצעות חשיפת Antigen פתרון (וקטור Labs; ברלינגיים, CA) לפי הוראות יצרן.
  5. מדורים מודגרת אז לילה ובימים נפרד בפתרונות שלהם נוגדן המכיל 0.1 M PBS/0.3% TX / NHS 3% (עם מקדם דילול של 1 / 5, 000 עבור FMRP ו - SMI-32 ו 1 / 2, 000 עבור נוגדנים NeuN.
  6. למחרת, חלקים נשטפים במשך שלוש תקופות של 10 דקות בתמיסה כביסה (0.1 M TX PBS/0.3%) ואחריו הדגירה של 2 שעות בטמפרטורת החדר נוגדן אנטי עכבר biotinylated משני וגדל סוס (וקטור Labs: 1 / דילול 1000 ב 0.1 M PBS/0.3% NHS TX / 3%).
  7. לאחר סדרה נוספת של 3 שוטף של 10 דקות, קטעי ממוקמים פתרון של מורכבות avidin-ביוטין חזרת מצומדות peroxidase (וקטור Labs) עבור 1 שעות בטמפרטורת החדר.
  8. לבסוף, לאחר סדרה נוספת של שוטף, הסעיפים חשופים במשך 10 דקות עד קוטר ניקל משופרתminobenzidine (Ni-DAB) תגובה המייצר כחול כהה כתם בתוך הנוירונים immunoreactive.
  9. בסיום ההליך היסטולוגית, קטעי הם רכובים על ג'לטין מצופה שקופיות הזכוכית.
  10. כל הסעיפים אוויר יבש במשך הלילה coverslipped פי נהלים קבועים.

חלק 3: תוצאות נציג:

שיטה זו יוצרת פרופיל הביטוי המלא של חלבון המטרה של עניין על פני מוח קוף כולו. כאן אנחנו מראים קטעים העטרה נציג המספקים תמונה של FMRP, NeuN ו SMI32 ביטוי במוח הקוף זהה.

איור 1: צלחת מכתים (א) ו - סל (ב) המשמש לעיבוד בקנה מידה גדול אצווה של ריחוף ללא חלקים עבור immunodetection.

איור 2: קטעים העטרה נציגת מוח קוף vervet מוכתם עבור FMRP (A), NeuN (B) SMI32 (C) נוגדנים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ישנם שני שלבים קריטיים בהליך זה שהופכים בקנה מידה גדול זיהוי של חלבונים במוח הקוף כל האפשר. האחד הוא פרוטוקול הטבעה ואת חתך, אשר נשאר הידע הקנייני של NSA. השני הוא השימוש של מנות מכתים וסלים מסופק על ידי HistoTools. זו האחרונה מאפשרת טיפול קל ומהיר של (~ 40) קטעים רבים בזמן נתון. הוא גם מספק את האמצעים לטיפול אחיד על פני כל חלקי המוח וגורמת לטיפול מדעית היסטולוגית קול. בנוסף, השימוש ציוני מוטבע מספק יתרון נוסף של היכולת דיגיטלית לרכוש את דפוסי מכתים משקופיות יבשים coverslipped ו לנושא קבצים דיגיטציה לצורות שונות של ניתוחים. למרות שאנו מספקים דוגמאות של שלושה נוגדנים, תהליך זה יכול להיות מיושם על מגוון רחב של חלבוני מטרה אחרים כמו גם כתמי היסטולוגית, במיוחד אלה החושפים cytoarchitecture אזורים שונים בקליפת המוח והשתמשו ומכאן למטרות מיפוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

אנו מודים פרנק ארווין, רוברטה Palmour ואנשי מדעי ההתנהגות קרן מעבדות ממוקם בסנט קיטס, הודו המערבית, על המשך התמיכה עבודתם הפרימטים שלנו. עבודה זו נתמכה על ידי מענק של X השביר קרן המחקר של קנדה (FXRFC) כדי SZ ו - מענקים ההפעלה המכונים הקנדי לבריאות מחקר (AC) ועל הנדסת הלאומי מועצת המחקר של קנדה (MP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-FMRP monoclonal antibody Chemicon International MAB2160 Requires antigen retrieval in fixed tissue.
anti-NeuN monoclonal antibody Chemicon International MAB377 N/A
anti-Neurofilament H monoclonal antibody Sternberger Monoclonals Inc. SMI32 N/A
Antigen Unmasking Solution Vector Laboratories H-3300 N/A
Normal horse serum Invitrogen 16050122 500 mL
Biotinylated Anti-Mouse IgG (H+L), made in horse Vector Laboratories BA-2000
VECTASTAIN ABC Kit (Standard) Vector Laboratories PK-4000 1.5 mg
Staining dish for floating sections HistoTools 10009 12 x 65 mm
Staining transport basket HistoTools 10012 large
(fits 12 x 65 mm dish)
Triton X-100 Fisher Scientific P8514B N/A
DAB Fisher Scientific AC11209-0050 N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guide to the Care and Use of Experimental Animals. Olfert, E. D., Cross, B. M., McWilliam, A. A. Canadian Council on Animal Care. Ottawa. (1993).
  2. Devys, D., Lutz, Y., Rouyer, N., Bellocq, J. P., Mandel, J. L. The FMR-1 protein is cytoplasmic, most abundant in neurons and appears normal in carriers of a fragile X premutation. Nat Genet. 4, 335-340 (1993).
  3. Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116, 201-211 (1992).
  4. Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proc Natl Acad Sci U S A. 80, 6126-6130 (1983).

Comments

2 Comments

  1. I am very interested in performing immunohistochemistry experiments in aged monkey brains. However, preliminary tests have shown very high endogeneous (lipofuscin??) autofluorescence in the tissue. Is there an effective way to get rid of autofluorescence in a manner that preserves the tissue for IHC?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 3, 2010 - 2:26 PM
  2. Hi Sergio,

    Here is a protocol used in my former lab with quite a bit of success:

    Reagent:
    70% (v/v) Ethanol containing 1% (w/v) sudan black B (stirred in the dark for ² h)

    Method
    1. Use a standard immunochemical staining protocol.
    ². Apply the reagent prepared above for 10 min at the step before incubation with the reagent conjugated to the fluorochrome.
    3. Quickly rinse the slides ten times in TBS or PBS.
    4. Continue with the immunochemical staining protocol.

    Hope this helps. Let me know how it turns out for you.
    Good luck,
    SZ

    Reply
    Posted by: Shahin Z.
    May 3, 2010 - 3:40 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics