Grabaciones de la activación de circuitos neuronales en animales comportarse libremente

Published 7/22/2009
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Biology

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Summary

Mediciones no invasivas de los patrones de actividad neuronal en animales de comportarse libremente se obtienen mediante la combinación de grabaciones neurofisiológicas con videografía de alta velocidad.

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Herberholz, J. Recordings of Neural Circuit Activation in Freely Behaving Animals. J. Vis. Exp. (29), e1297, doi:10.3791/1297 (2009).

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Abstract

La relación entre los patrones de actividad neuronal y la expresión del comportamiento que corresponde es difícil de establecer en los animales sin restricciones. Tradicionales métodos no invasivos requieren los sujetos de investigación, al menos parcialmente restringido, y sólo permiten la identificación de un gran número de neuronas al mismo tiempo activa. Por otro lado, pequeños conjuntos de neuronas o de las neuronas individuales sólo pueden medirse utilizando una sola célula grabaciones obtenidas a partir de preparaciones reducido en gran medida. Dado que la expresión del comportamiento natural de los animales es limitada en contenido y disecados, los mecanismos subyacentes a los nervios que controlan el comportamiento son difíciles de identificar.

Aquí les presento una técnica fisiológica no invasiva que permite medir la activación de circuitos neuronales en comportarse libremente los animales. Con un par de electrodos de alambre dentro de una cámara llena de agua, los electrodos de baño de registrar los potenciales de campo neuronal y muscular generada por cangrejos juveniles durante las respuestas de escape natural o inducidas experimentalmente. Las respuestas de escape primario de cangrejos de río están mediados por tres tipos diferentes de cola-flips que se mueven los animales lejos del punto de estimulación. Cada tipo de cola de la moneda es controlada por su propio circuito neuronal, los dos mejores y más poderosas respuestas de escape requieren la activación de los diferentes conjuntos de neuronas de comandos de gran tamaño. En combinación con observaciones de la conducta, las grabaciones de electrodos baño permiten una identificación inequívoca de las neuronas y los circuitos asociados neural. Así, la actividad de los circuitos neuronales que subyacen al comportamiento natural se puede medir en los animales sin restricciones y en diferentes contextos de comportamiento.

Protocol

Parte 1: cámara de grabación

  1. La cámara de grabación es de forma rectangular y está hecha de vidrio de paredes delgadas. Dimensiones de la cámara son de 8,5 cm x 2 cm x 5 cm (largo x ancho x alto) para los animales de 2,5 a 3,5 cm de longitud total (medida a partir de tribuna para telson).
    Ver fig. 1 para un ejemplo de una cámara utilizada en nuestros experimentos.
  2. Por otra parte, las cámaras de grabación se puede hacer con otros materiales (por ejemplo, no tóxica de plástico transparente). Tamaño de las cámaras puede variar de acuerdo con el procedimiento experimental y las cámaras debe ser personalizado para cada serie experimental. Para mejores resultados, tamaño de la cámara debe ser lo más pequeña posible, sin restricción de los animales en su comportamiento natural. Como regla general, la longitud y la anchura de la cámara no debe tener más de tres veces el tamaño del animal.

Parte 2: Baño de electrodos y alambre de tierra

  1. Un par de electrodos de registro y un electrodo de tierra se utilizan. Los electrodos están hechos de alambre de cobre aislado (26 AWG con aislamiento de 0,25 mm). Uno de los extremos de los electrodos de baño está conectado a un amplificador extracelular (AM Sistemas de 1700, véase más adelante) y 0,5 - 1,0 mm de aislamiento se quitó el otro extremo. El cable de tierra está conectada a la tierra del amplificador o cualquier otro equipo conectado a tierra y 2.3 cm de aislamiento se quitó el otro extremo.
  2. Electrodos de baño y conexión a tierra se unen a las paredes interiores de la cámara de grabación con pegamento no tóxico. Electrodos de registro se colocará en el centro en ambos lados cortos de la cámara y opuestas entre sí (Fig. 1).
  3. Electrodo de masa se coloca en un lado largo de la perpendicular de la cámara de grabación para los electrodos de registro (Fig. 1).
  4. Cámara se llena con agua destilada. Los mejores resultados se obtienen con agua de alta resistencia (~ 18 MW).

Parte 3: Las grabaciones de baño electrodo

  1. Las salidas de electrodos de registro se amplifican (1000x) por un amplificador extracelular (Sistemas de AM, modelo 1700). Señal de los electrodos de registro se filtra utilizando una combinación de baja frecuencia (<100 Hz) y alta frecuencia de corte (> 5 KHz). La señal se conecta a una caja de distribución y una tarjeta de adquisición de datos (National Instruments). Los datos digitalizados se registra, almacena, y se analizaron usando el software de adquisición de datos (Photron Herramientas de movimiento).
  2. Por otra parte, la señal amplificada de electrodos de registro se pueden digitalizar con otros convertidores analógico-digital (por ejemplo, MDS tecnologías analíticas; Digidata 1440) antes de los datos digitalizados se registra el uso de software de otros datos disponibles en el mercado de adquisición (por ejemplo, MDS tecnologías analíticas; Axoscope).

Parte 4: Estimular la investigación

  1. Una sonda de estimulación se hace de una pipeta de vidrio (14 cm de longitud), equipado con un par de electrodos de alambre fino. Puntas de los electrodos están expuestos (0,2 mm) para producir una señal electrónica cuando el animal está tocado por la sonda. Esto permite medir el tiempo exacto de la estimulación.
  2. Resultados de la sonda estimulante se amplifican (1000x) por un amplificador extracelular (Sistemas de AM, modelo 1700). Se filtra la señal mediante una combinación de baja frecuencia (<100 Hz) y alta frecuencia de corte (> 5 KHz). La señal se conecta a una caja de distribución y una tarjeta de adquisición de datos (National Instruments). Los datos digitalizados se registra, almacena, y se analizaron usando el software de adquisición de datos (Photron Herramientas de movimiento).

Parte 5: Las grabaciones de vídeo

  1. Una cámara de video de alta velocidad (FastCam-X 1280 PCI, Photron) se coloca perpendicular a la cámara de registro para proporcionar una vista lateral. Nivel de brillo dentro de la cámara de registro debe ser ajustado para proporcionar los mejores resultados, por ejemplo, mediante el uso de un iluminador de cuello de ganso o de otras fuentes de luz enfocable.
  2. Videografía de alta velocidad se combina y se sincronizan con grabaciones electrónicas utilizando una caja de conexiones y datos de tarjeta de adquisición (National Instruments). Señal amplificada de los electrodos de baño está conectado a la caja de conexiones y tabla de adquisición de datos utilizando cables BNC. Externo a mano el interruptor de disparo inicia la adquisición sincronizada de vídeo y datos.

Parte 6: El procedimiento experimental

  1. Un solo animal se introduce en la cámara y se les permitió aclimatarse durante 5 minutos. Escapar de la cola-flips son provocados por los grifos individuales de diferente intensidad en la cabeza o el abdomen, respectivamente. La intensidad de los grifos es controlado por el experimentador. Cada cola de escape-tapa está grabado con video de alta velocidad a una velocidad de 1000 f / s, y los puntos de datos de los potenciales de campo electrónico se registran a 25 kHz. Inicio de la bañera y grabación de vídeo se inicia con interruptor manual en una caja de disparo. El tiempo de grabación está determinado por la velocidad de fotogramas seleccionados (por ejemplo, 1000 f / s = 4 segundos el tiempo total de grabación). Post-y pre-trigger tiempos de grabación se puede seleccionar.
  2. Noe: grabaciones de baño electrodo debe ser verificado una vez para cada especie estudiada mediante la combinación de grabaciones de baño electrodo con otros métodos de grabación disponible. En cangrejos de río, un par de electrodos de plata puede ser implantado quirúrgicamente en todo el cordón nervioso ventral. Estímulos provocando la cola-flips de escape pueden ser aplicadas y registradas las huellas electrónicas de electrodos implantados y baño se pueden comparar.
  3. Escapar de la cola-flip comportamiento y la actividad neuronal correspondiente se puede grabar en una variedad de contextos diferentes, por ejemplo, en respuesta a las amenazas visual, durante los ataques de los depredadores, o durante los encuentros agonísticos de dos cangrejos de río. Tamaño de la cámara, modo de grabación, etc tiene que ser ajustado en consecuencia (ver Discusión).

Parte 7: Análisis de los datos

  1. Cuadros de vídeo individuales se analizaron mediante el software de movimiento de la herramienta (Photron). Huellas electrónicas se utilizan para identificar el tipo de circuito neural que se activa por cada estímulo. Los datos de video se compara con las grabaciones sincronizadas fisiológicas para determinar el movimiento de los animales y el circuito neuronal activado. Cada circuito activado produce una firma característica electrónico (ver resultados representativos).
  2. Latencia entre el contacto de la sonda y la respuesta neural / muscular se calculan para cada experimento midiendo el retraso entre el inicio de la señal de la sonda y la aparición de la señal grabada con los electrodos de baño.

Parte 8: Los resultados representativos

Una serie de fotogramas de vídeo individuales de alta velocidad y sus correspondientes grabaciones de campo eléctrico para escapar de la cola-flip en respuesta a un estímulo táctil entregado a la cabeza o la cola de un cangrejo de río juvenil (Fig. 2).

Fig. 2A: fuerte estímulo táctil en la cabeza provocado una cola de flip-controlada por el gigante del circuito medial. El alza registrada por la neurona gigante (asteriscos) y la desviación de grandes fásica que sigue permite identificación no-ambigua de la cola-flip, mediada por la actividad de las neuronas gigantes. El retroceso se muestra en las huellas de vídeo determina la identidad de los circuitos neuronales activados (MG).

Fig. 2B: Cola-flip mediada por el circuito gigante lateral después de un fuerte estímulo táctil se aplicó a la cola. Movimiento hacia arriba y hacia delante se ve en el video junto con los rastros de la traza sincronizada electrónica que muestra el enorme pico y la desviación grande, inicial fásica determina la identidad de los circuitos neuronales activados (LG).

Fig. 2C: Cola-flip controlados por circuitos no gigantes. Un estímulo táctil más gradual fue entregado en el tórax del animal. Mientras que el movimiento capturado en video no permite la identificación inequívoca del circuito se activa, el registro electrónico no tiene un pico enorme y consiste en la identificación de desviaciones mucho menor el circuito activo (no-G).

Fig. 3: Las mediciones de latencia para los tres tipos de escapar de la cola-flips. Tiempo entre el contacto de la sonda y la respuesta fisiológica se midió por siete animales. Gigante mediada por la cola-flips son provocados significativamente más rápido que no gigantes cola mueve de un tirón.

Figura 1: Un ejemplo de una cámara de registro utilizado en nuestros experimentos en animales de 2,5-3,5 cm de longitud total. Los electrodos de baño están pegados a los lados opuestos de la cámara, mientras que el cable de tierra está conectada a la parte larga de la cámara y perpendicular a los electrodos de baño.

Figura 2: los solos marcos video grabado en 1000 grabaciones f / s, y que corresponde electrónicos para tres diferentes tipos de estimulación.

A) Un estímulo táctil fuerte fue entregado a la cabeza del animal y obtuvo un gigante medial (MG) ​​mediada por la cola-flip. Seis de vídeo se muestran imágenes de la izquierda. Rastro de grabación de la sonda utilizada para tocar el animal se muestra en gris, el punto de contacto se indica por la flecha negro. Rastrear la grabación obtenida con los electrodos de baño se muestra en azul. El recuadro muestra la punta del axón gigante pequeño que precede a las desviaciones fásica grandes. Barras grises corresponden a los fotogramas de vídeo, muestra a la izquierda. El primer movimiento notable de la cola del cangrejo de río se produjo en el marco # 3, siete milésimas de segundo después del contacto con la sonda.

B) Un estímulo táctil fuerte fue entregado a la cola del animal y obtuvo un gigante lateral (LG) mediada por la cola-flip. Seis de vídeo se muestran imágenes de la izquierda. Rastro de grabación de la sonda utilizada para tocar el animal se muestra en gris, el punto de contacto se indica por la flecha negro. Rastrear la grabación obtenida con elelectrodos de baño se muestra en rojo. El recuadro muestra la punta del axón gigante pequeño que precede a las desviaciones fásica grandes. Barras grises corresponden a los fotogramas de vídeo, muestra a la izquierda. El primer movimiento notable de la cola del cangrejo de río se produjo en el marco # 3, ocho milésimas de segundo después del contacto con la sonda.

C) Un estímulo táctil débil y gradual fue entregado a la cabeza del animal y obtuvo un no gigante (Non-G) mediada por la cola-flip. Ocho de vídeo se muestran imágenes de la izquierda. Rastro de grabación de la sonda utilizada para tocar el animal se muestra en gris, el punto de contacto se indica por la flecha negro. Rastrear la grabación obtenida con los electrodos de baño se muestra en negro. La huella no tiene el gigante potencial pico, las desviaciones iniciales grandes y se compone de los potenciales de amplitud mucho menor. Luz barras grises corresponden a los fotogramas de vídeo, muestra a la izquierda. El primer movimiento notable de la cola del cangrejo de río se produjo en el marco # 6, 115 milésimas de segundo después del primer contacto con la sonda.

Figura 3: Medidas de respuesta de latencia de siete animales diferentes, de ambos sexos y tamaños similares (media ± stdv longitud: 3,2 cm ± 0,2 cm, medida desde tribuna para telson). MG (barra azul) y LG (barra roja) cola invierte significativamente menor latencia de respuesta que la cola mueve de un tirón-mediada por la no-G (barra de color negro) de circuitos. Medias y desviaciones estándar se muestran. Barras con la misma letra no difieren significativamente entre sí (test de Wilcoxon para la comparación por pares, p <0,05).

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Discussion

No invasiva de las grabaciones de la actividad de las neuronas individuales o activación de circuitos neuronales son difíciles de obtener en los animales sin restricciones. El método descrito aquí proporciona un medio para identificar los patrones de activación neuronal subyacente natural comportamiento.

En el pasado, hemos utilizado con éxito esta técnica para medir los patrones de actividad en los circuitos neuronales de escape de los cangrejos de menores durante la formación de jerarquías de dominancia social 1, durante los ataques de los depredadores naturales de 2, y más recientemente, en respuesta a las amenazas visual 3. En la actualidad, usamos grabaciones sincronizadas electrodo de baño de alta velocidad y grabaciones de vídeo para medir la importancia de los movimientos de los apéndices en la cabeza durante la ejecución de conductas de escape en el cangrejo de río.

Mientras que esta técnica sólo se ha utilizado en dos diferentes especies de invertebrados (cangrejos y libélulas) y en dos laboratorios diferentes, 4, parece probable que pueda aplicarse a otros sistemas de modelos animales, incluyendo vertebrados, algunos de los cuales son los comportamientos acuáticos y expresar que son controlados por neuronas de gran tamaño. Por ejemplo, una respuesta rápida fuga de los peces teleósteos muchos son controlados por las células de Mauthner, grandes neuronas de identificación 5. Escapar de la conducta mediada por las células de Mauthner ha recibido mucha atención en la literatura y se ha estudiado en varios niveles de análisis, sin embargo, existe una creciente evidencia de que las células de Mauthner control de giros rápidos del cuerpo en situaciones que no están relacionados con escapar de 6,7. La evidencia, sin embargo, es en su mayoría derivados de la comparación de las variables cinemáticas de los comportamientos y no de mediciones directas de la actividad de las células de Mauthner. Puede que sea factible el uso de grabaciones de baño electrodo en combinación con la videografía de alta velocidad para medir los potenciales de campo generada por las células de Mauthner o asociada la actividad muscular.

Además de su valor científico, la técnica descrita aquí es también ideal para fines educativos (por ejemplo, laboratorios universitarios de enseñanza), debido a su simplicidad y bajo costo total.

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Acknowledgements

La técnica de grabación de baño se utilizó por primera vez por Fricke (1984) 8 y Beall et al. (1990) 9 para medir los campos eléctricos generados en la cola mueve de un tirón. La técnica fue posteriormente modificada y mejorada en el laboratorio del Dr. Donald Edwards (Georgia State University) por su ex estudiante graduado de Dr. Fadi A. Issa y su ex asociado postdoctoral Dr. Jens Herberholz. Otras mejoras se han hecho y las nuevas aplicaciones de investigación han sido probados en el laboratorio del Dr. Jens Herberholz en la Universidad de Maryland. Me gustaría agradecer a mi colega, el Dr. David Yager por dejarme usar su sistema de alta velocidad de vídeo y mis asistentes de investigación David Rotstein y Liden William para obtener ayuda con los experimentos.

References

  1. Herberholz, J., Issa, F. A., Edwards, D. H. Patterns of neural circuit activation and behavior during dominance hierarchy formation in freely behaving crayfish. J. Neurosci. 21, 2759-2767 (2001).
  2. Herberholz, J., Sen, M. M., Edwards, D. H. Escape behavior and escape circuit activation in juvenile crayfish during prey-predator interactions. J. Exp. Biol. 207, 1855-1863 (2004).
  3. Liden, W. H., Herberholz, J. Behavioral and neural responses of juvenile crayfish to moving shadows.J. Exp. Biol. 211, 1355-1361 (2008).
  4. Finley, L. A., Macmillan, D. L. An analysis of field potentials during different tailflip behaviours in crayfish. Mar. Freshw. Behav. Physiol. 35, 221-234 (2002).
  5. Eaton, R. C., Lee, R. K. K., Foreman, M. B. The Mauthner cell and other identified neurons of the brainstem escape network of fish. Prog. Neurobiol. 63, 467-485 (2001).
  6. Canfield, J. G. Some voluntary C-bends may be Mauthner neuron initiated. J. Comp. Physiol. A. 193, 1055-1064 (2007).
  7. Wöhl, S., Schuster, S. The predictive start of hunting archer fish: a flexible and precise motor pattern performed with the kinematics of an escape C-start. J. Exp. Biol. 210, 311-324 (2007).
  8. Fricke, R. A. Development of habituation in the crayfish due to selective weakening of electrical synapses. Brain Res. 322, 139-143 (1984).
  9. Beall, S. P., Langley, D. J., Edwards, D. H. Inhibition of escape tailflip in crayfish during backward walking and the defense posture. J. Exp. Biol. 152, 577-582 (1990).

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