大規模な挿入環境ゲノムライブラリーの製造

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

季節低酸素フィヨルドの垂直方向の深さの連続体から分離された環境ゲノムDNAとのフォスミドライブラリーの構築が記載されている。得られたクローンのライブラリーは384ウェルプレートに取り、自動コロニーピッキングシステムのアプリケーションによって下流の塩基配列決定と機能的スクリーニングのためにアーカイブされます。

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. Large Insert Environmental Genomic Library Production. J. Vis. Exp. (31), e1387, doi:10.3791/1387 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

自然界における微生物の大半は現在、従来の栽培方法にアクセスできないままです。過去10年間、カルチャに依存しない環境ゲノム(

Protocol

フォスミドライブラリー構築は、4つの主要なステップと(概要については、図1を参照)いくつかの部分に分け、サブに分かれています。

ステップI([3]"0.22μmのSterivexフィルタからのDNA抽出"プロトコルを参照してください)

パート1:酵素触媒による細胞溶解

パート2:CsCl密度勾配遠心分離とDNAの回収による環境DNAの精製

パート3:ゲル電気泳動により抽出されたDNAの品質管理

ステップII

パート1:回収された環境DNAの酵素的修飾の手順

環境DNAの末端の修復ステップに必要なすべての試薬はEPICENTREからPCC1フォスミドライブラリーの製造キットに含まれています。理想的には、ゲノムDNAの0.5μg/μlに調整する必要があります。

  1. 氷の上にすべての試薬を解凍、以下を組み合わせて、簡単に底にすべての液体を得るためにチューブを遠心。
    • Xμlの滅菌水
    • 8μlの10Xエンド修理バッファ
    • 8μlの2.5 mMのdNTPミックス
    • 8μlの10 mMのATP
    • 最大20μgのインサートDNAを(〜の0.5μg/μl)を剪毛した
    • 4μlのエンド修復酵素ミックス
    • 80μlの総反応容量
  2. 最大60分、熱が70℃酵素ミックスを不活性化するために45分の最小時間室温でインキュベート℃で10分(平均時間で、エンド修理のその後のサイズ選択のための低融点アガロースゲルを準備するためのC DNAは、下記参照)。

パート2:パルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)によりゲノムDNAのサイズセレクション

  1. 1.0X TAE泳動緩衝液150 mLの低融点アガロース1.5gを再び中断して、小型のマグネチックスターラーバーを追加する。電子レンジラップでフラスコをカバーし、アガロースが完全に溶解するまで電子レンジですぐに沸騰。それはゲルトレイ(〜60 ° C)に注ぐのに十分な寒さになるまでのソリューションをかき混ぜる。
    注意:ゲルや泳動バッファーのどちらかエチジウムブロマイドやSYBR Goldを含んでいない。
  2. あなたのゲルをキャストし、あなたに1つ鉱石トゥーウェルス(ローディングバッファー80μlのプラス適量)に完全なエンド補修ミックスをロードするのに十分なスペースを与える櫛を選択するゲルトレイを組み立てます。
  3. 電気室に1.0X TAEの2.2 Lを入れ、ランニング緩衝液を循環させるためにマシンの電源を入れ、14℃に冷却装置を設定するポンプは、実行中のバッファの十分な循環を確保するために70 rpmで実行し、14でバッファを保持℃以下とします。
  4. それが冷却された後も横ばい表面にゲルをトレイに溶かしたアガロースを注ぎ、あなたが泡を避けることを確認してください。溶融アガロースもゲルのくしになっているか確認します、そうでなければ櫛を削除し、溶融アガロースに戻します。ゲルが固化されると、コームを抜き取るとミッドレンジの私はゲルの第四井の中のマーカーをPFGをロードする。押し出しアガロースメスと端からゲルの注射器とスライスから小さなプラグ。よく目の前にプラグを取り付けて、溶融アガロースでシールする。電気泳動槽にゲルを置きます。
    注:簡単に低融点ゲルのブレーキとしては非常に慎重にアガロースゲルを扱う。あなたのゲルのロードを開始° Cの前に実行してバッファが14に冷えているか確認してください。あなたの井戸をアガロースによってブロックを見てみると、以下次回にしてみてください:あなたがゲルからコームを削除する前に、櫛の周りに1 - 2mLのTAE緩衝液を加える、これはよりよい井戸になります。
  5. λHindIIIでダイジェストの最初のよく負荷5μlのフォスミド、コントロールのサイズマーカーの1μL(EPICENTRE、100 ng /μLの)が続く。マイクロ遠心チューブのサイズマーカーだけでなく、ローディングバッファーの適切な量に滅菌水10μlを追加します。大きなボリュームでは、簡単にゲルをロードできるようになります。直接フォスミドマーカーの隣にロードして、エンド修理とローディングバッファーの適切な量の熱不活化混合。蓋とプログラムの設定を閉じます。
    注:私たちは本当に大まかにDNA量を定量化したり、ゲノムDNAの切断の程度を視覚化するために他のDNAラダーの異なる量をロードすることをお勧めします。理想的なサイズマーカーはλDNA - HindIIIでダイジェストし、ミッドレンジの私PFGマーカー(NEBか​​らの両方)です。
  6. プログラムの設定:お使いのPFGEシステムはこの装備されている場合、自動アルゴリズムを使用する。プログラムが自動的に指定されたサイズの範囲のDNAを分離するために必要な設定を計算します。使用される設定は次のとおりです。DNAのサイズ範囲2から250 KB、キャリブレーション係数:1;勾配:[6 V / cm]の、実行時:12:00、開先角度:120 °、初期の切り替え時間:0.1秒、最終的なスイッチング時間:21.79秒、ランピング係数=線形。
  7. あなたのDNAを可視化するために、コンテナに1.0X TAE緩衝液250 mLを注ぎ、10.000X SYBR Goldの25μLを加え、あなたが解決策にあなたのゲルを置く前に穏やかに混合する。 SYBR Goldは敏感な光であるため、暗所で1時間のためにゲルを染色する。
    注意:お使いの処理garoseゲルは非常に慎重に低融点ゲルは、簡単にブレーキとして。

パート3:回収したDNAのゲル抽出し、ライゲーションによってフォスミドクローニングベクターへのDNA回収

この部分のすべての試薬はEPICENTREフォスミドライブラリの制作キットに含まれています。

  1. 平均時間で70℃、45一°ゲル内消化のステップのためのCの水浴を用意。
  2. 空の風袋マイクロ遠心チューブと青色光トランスに滅菌メスと一緒に染色したゲルを取る。あなたのエンド修理ゲノムDNA及びフォスミドコントロールのサイズマーカーを視覚化する。消費税​​でと少しフォスミド、コントロールのサイズマーカーの位置(全体の5〜7ミリメートルである消費税ゲルスライス)上に移行され、風袋マイクロ遠心チューブにスライスを転送メスでゲルスライスを。ミッドレンジこれは高すぎるゲルを切断しないために役立つように私はあなたのゲル上でマーカーをPFGを実行します。
    注:交差汚染を防止し、青色光をオンにする前に表示するメガネを着用するようにしてゲルを置く前に、青色光トランスにプラスチック製のラップを築く。これは不要なキメラクローンにつながるとしてゲノムDNAは、フォスミド、コントロールのサイズのマーカーよりも小さい消費税ゲルスライスはしないでください。
    あなたはそれぞれ、全ゲノムショットガンやBACライブラリーを構築するための低い、または高い分子量のDNAを含むゲルスライスを切り取って保存することができます。
    私を停止する:回復ゲルスライス(s)は最長1年間、-20℃で保存することができます
  3. 風袋チューブの重量を測定し、ゲルスライス(複数可)の重量を計算する。アガロース1 mgのは溶融アガロースの約1μlを得られます。
  4. 70℃10〜15分のためのC(我々はgelaseバッファを追加しない)。℃の水浴でゲノムDNAを含有する低融点アガロースを溶かすあなたのゲルスライスが完全に溶融された後、45に迅速にチューブを移す℃に
    注意:ボルテックス、サンプルをこのせん断あなたのDNAをかもしれないとして溶解を助けるためにしない。
  5. 溶融アガロース100μlのあたりGELase酵素調製物の1 U(1μlの)を追加します。 1時間45℃でインキュベートし、より多くのGELase(2-4μl)を追加し、さらに1時間インキュベートする。 70 GELase酵素製剤を不活性化熱し℃で10分間。
    氷上で10分間チューブを配置し、ペレットに15分、不溶性の粒子の最大速度(13,000 rpm)でチューブを遠心する。慎重に上部の上清を取り除き、15 mLのファルコンチューブに移すとチューブに滅菌水3 mLを加える。
    注:任意のペレットアガロースをピペッティングを避ける。私たちは別々に我々の順序余分GELaseの酵素調製物、キットに含まれているよりも多くのGELaseを追加するとして。
  6. Ultracel - 10膜をアミコンウルトラ-4遠心フィルターユニットにソリューションを転送して6-8分、4,000 gでチューブをスピンし、フロースルーを捨てる。フィルター上に液量が約100に減少するまで心する〜500μlを。上記から空のファルコンチューブに滅菌水の別の3 mlを添加し、アミコンチューブにソリューションを転送し、遠心分離のステップを繰り返します。水3mLで三回目を洗い、再びフロースルーを捨てる。 100μlの - 50〜最終容積を減らす。
    注:我々は遠心分離のステップのためにスイングバケットローターを使用して、単に遠心分離中に所定の位置に保持するために50mLのファルコンチューブにアミコン遠心フィルターユニットを配置。アミコンフィルターは安全にさえ長時間遠心分離した後、フィルター上に溶液50​​μlを保持します。
  7. あらかじめ洗浄マイクロコンYM - 50遠心フィルターユニットにアミコンチューブから残りのDNA溶液を移し、すべてのDNAを回収するために滅菌水の追加の50μlをアミコンチューブをリンス。遠心操作をマイクロコンYM - 50 10,000 gで遠心の遠心フィルターユニットフィルタがまだわずかに液体で覆われるまで。液体の少量がフィルターに残っている場合、毎分をチェックしてください。フィルターを裏返し、新しい微量遠心管中で3分間、1,000 gで第二の遠心分離工程によってあなたのDNA溶液を回復する。結果として得られるボリュームが合計で10〜15μlを超えてはならない、そうでなければ、あなたのDNAは、あまりにもライゲーション工程中で希釈されることがあります。
    注意:乾燥を完了するには、フィルターデバイスを回転しないように注意してください。あなたのメンブレンが乾燥している場合、その後、メンブレンに10〜15μlの水を追加して30秒間静かに撹拌し、上記のようにDNAを回収。
  8. 光度計またはPicoGreenアッセイすることにより、結果としてDNA溶液を定量化する。
  9. 回収されたエンド修理DNAは今やPCC1 -フォスミドクローニングベクターにライゲーションする準備が整いました。氷の上で、以下のソリューションを解凍し、モル比を挿入するためにベクトルが10:1であることを確認してください。
    注:0.5μgのPCC1 -フォスミドベクトル〜0.09ピコモルのベクトル。
    〜40 KBインサートDNA〜0.009ピコモルインサートDNA0.25μgの
    メッキはE.を感染後にわずか数フォスミドクローンを得る必要がある場合はライゲーション工程で使用されているDNAの量を増やすと便利かもしれません上の大腸菌細胞選択培地。

    以下の順番で試薬を追加し、簡単に、底にすべての液体を得るためにチューブを遠心チューブをタップして、再度スピン。

    • Xμlの滅菌水
    • 1μlの10X高速リンクのライゲーションバッファー
    • 1μlの10 mMのATP
    • 1μlのPCC1 -フォスミドベクター(0.5μg/μLの)
    • Xμlの濃縮されたインサートDNA(0.25μg)を
    • 1μlの高速リンクのDNAリガーゼ
    • 10μlの総反応容量
  10. 2時間室温でインキュベートし、熱は70℃10分間酵素を失活℃を
    II停止:店舗のライゲーション混合物-20℃で保存するか、またはファージのパッケージングのステップに進みます。
    注:単一のライゲーション反応は、環境DNAの質に応じて10 3〜10 6個のクローンを生成します。特定の範囲のために必要とされるクローンの推定数に基づいて、ライゲーション反応をスケールアップできます。ライゲーションをスケールアップされている場合は下記のように、その後、ファージパッケージング抽出物の量はそれに応じてスケールアップする必要があります。

ステップIII

パート1:ベクトルインサートライゲーション産物のファージパッケージング

  1. 意図したファージのパッケージングのストリークが出て37℃一晩プレーンLBプレートとインキュベート上EPI300 - T1 Rメッキ株を提供する二、三日前に° C、単一コロニーを得ること。このプレートは4℃で将来の使用のために密封して保存することができます。
  2. LBブロスのパッケージング反応の接種を50mLの前日+ 10mMのMgSO 4を手順1で生成されたプレートの単一コロニーを(500μlの1M MgSO 4を追加)。 225 rpmで、37℃で一晩振とうする。
  3. パッケージング反応の日は、ステップ2で調製した一晩培養液5mLを新鮮な50mLのLBブロス+ 10mMのMgSO 4を接種する。 1.0に0.8のOD 600に37℃で成長し、1.0のOD 600を超えないようにしてください!あなたが正確な結果を得られるように、分光光度計で測定する前にサンプルを希釈する。さらに使用° Cまで、氷上もしくは4℃ストア細胞。
    注:IIIを停止:文化は必要に応じて、最大72時間まで4℃で保存してもよいが新鮮育った文化の使​​用は強く推奨されます。
  4. 氷上で解凍、、MaxPlaxラムダパッケージングエキス、以前に実施したすべてのライゲーション反応は1チューブ。融解は10〜15分かかります。一方、あらかじめ冷却に氷上にセットした1.5​​ mlチューブを置きます。
    注:長すぎる氷上で解凍したファージを残さないようにしてください。そうでなければファージ感染効率が低下します。
  5. 融解後直ちに第二予備冷却1.5mlマイクロチューブと氷の上の場所にそれぞれのパッケージング抽出物25μlを転送する。 80℃ - に残りのパッケージングエキスを返す
    注意:ドライアイスまたはその他のCO 2のソースとパッキング抽出を保管しないでください。
  6. 氷上で融解抽出液のそれぞれを25μlのライゲーション反応を10μlを添加します。ソリューションを数回ピペッティングして混ぜる、空気の気泡を導入することは避けてください。簡単に言えばチューブの底にすべての液体を取得し、30℃で90分間包装反応をインキュベートするチューブを遠心してください。氷の上でパッケージングエキスを、残りのインキュベーションの雪解けの80分後。
    注:30℃インキュベーションのステップのために水浴ではなく、ヒートブロックを使用する。
  7. 90分のパッケージング反応が完了した後、各反応チューブにパッケージングエキスの残りの25μlを加える。 30℃でさらに90分間反応をインキュベート℃に90分のインキュベーションの後、各パッケージのチューブで調製したファージ希釈バッファー100μlを加え、穏やかに混合する。
    注:効率は、最後に低くなければならない場合、あなたのファージの抽出物が古すぎるかもしれないまたはドライアイスや他のCO 2のソースにさらされている。我々の経験では、30℃で2時間の最終的な追加のインキュベーションに続いて代わりに30℃の室温(2回90分)でのファージのパッケージングは​​、° Cで得られたクローンの量を増加した。
  8. 各チューブにクロロホルムの5μlを加え、チューブにある165軒全量、その結果軽く混ぜる。粘性の沈殿物は、クロロホルムを添加後、形成することができ、これはライブラリの生産を妨げることはありません。ファージ粒子をピペッティングしたときただし、この沈殿物だけでなく、有機クロロホルム相を避ける。
    IVを停止する:この時点でパッケージ化されたファージ粒子を4で数日間℃で保存することができます
    注:最高のファージの感染効率のために、新鮮なパッケージ化されたファージを使用する。

パート2:ライブラリ宿主大腸菌の感染大腸菌

  1. ファージ粒子の各10μlのためのEPI300 - T1 R細胞の400μlの比率でEPI300 - T1 Rの宿主細胞(OD 600 = 0.8から1.0)にパッケージ化されたファージを追加。我々はパッケージ化されたファージ粒子と準備EPI300 - T1 Rの宿主細胞を5mLの125μlを使用するすべてのクロロホルムをピペッティングを避けるために。静かに混和し、37℃で30分間を。
    注:ファージのパッケージングチューブからファージ粒子を除去するときに宿主細胞にクロロホルムを転送しないように注意してください。あなたがわからない場合は、パッケージ化さファージ粒子の少なくしてください。

第3部:メッキとタイター

  1. 四つの小LB + 12.5μg/ mLのクロラムフェニコールペトリ皿5-7滅菌ガラスビーズを追加。
  2. 2回50μlの2倍、4つの独立したプレート上EPI300 - T1 R細胞を感染したファージ10μlを広げる。拡散さえ確保するために、ファージ感染細胞10μlをプレートにいくつかのLBブロスを(〜50μl)を加える。水平方向に均等にプレート上に細胞を分散させるプレートを横に振る。 15分間プレートを乾燥させて、その後反転プレートによりビーズを取り除く。
    注:これらのプレートは、形質転換体の数を決定し、高すぎるコロニーの密度を避けるために、コロニーピッキングの段階で適切な希釈を計算するために使用されています。
  3. コロニーの形になるまで48時間まで16〜24時間37℃のインキュベーターで逆さまにプレートを置きます。近隣のコロニーに成長の急成長のクローンを防ぐために、24時間後にプレートを確認してください。
  4. 一方、4℃で10分間、3500グラム℃で遠心分離して5 mLの感染から、余った残りの細胞を採取する上清を捨てる。チューブに1 mLのLB / 20%グリセロールを追加。 100μlの2 mLのクライオバイアルチューブのそれぞれに細胞ペレットと注し、それを再度停止。直ちに凍結し、-80℃で保存コロニーピッキングのステップでさらに使用するためにCを。
  5. 翌日、プレート上のクローンの数をカウントし、力価を決定する。フォスミドクローンの合計金額を計算するために適切な希釈係数を含めるようにしてください。
    注:この手順は、合計で10,000と50,000フォスミドクローンの間で生成するが抽出した環境DNAの品質と純度に応じて、80,000 Fosmidクローンから3,000の範囲が観察される。

ステップIV

パート1:寒天とウェルプレートの準備

  1. 次のようにプレートに培地を注ぎ、mLのLB当たり12.5μgのクロラムフェニコールが含まれています。
    • 100X15mmペトリ皿:25mLのLB寒天
    • 150X15mmペトリ皿:50mLのLB寒天培地
    • 245X245mm正方形のバイオアッセイプレート:250mlのLB寒天培地
    注:プレートに均等に寒天の深さを作るためにも水平に表面上のメディアを注ぐことが重要です。私達は多くのプレートを処理する必要はありませんので、フォスミドライブラリーの245X245 mmプレートを使用することをお勧めします。
  2. あなたのグリセロールストックが氷の上に準備したフォスミドクローンを含む解凍。あなたが計算された力価(グリセロールストックを準備すること、さらにあなたの細胞を集中〜5倍)に基づいて、使用するプレートのための適切な量を広げる。細胞増殖のためのインキュベーション時間は、37℃で24時間Cです。
    Vを停止する:それらはコロニーピッキングのステップで使用されるまで、コロニーが形成されたときに、最長1ヶ月間4℃で密封された寒天プレートを格納します。
    注:コロニーは、均等に分散する必要が互いに十分に遠いと、直径約1mmの成長をしてください。ガラスビーズを用いて細胞を播種するとコロニーの間の良好な分離を生成することができます。 100X15mmペトリ皿、通常150〜250コロニーで最高のロボットピッキング効率のためとは2,000以上のコロニーが得られることは22 × 22 cmの良い密度です。
  3. コロニーピッキングの日には、-80℃で12.5μgのmLの培養液あたりのクロラムフェニコールだけでなく、ライブラリのストレージは20%グリセロールを添加したLBブロス℃で満たされた96または384ウェルプレートを準備ウェルプレートは、後述するように自動化されたQFill3プレート充填システムで充填される。
  4. ガラスびん(500mL)で、蓋とシリコンチューブのオートクレーブ2セット。ニードルアセンブリおよび取り付けフランジを含むオートクレーブマニホールドは、しないでください。ブンゼンのバーナーの炎の近くや無菌環境を作成し、維持するためにボンネット内QFill3を組み立てます。
    注意:シリコンチューブをピンチバルブアクティベータを押すと、完全にバルブにチューブをスライドさせて、ピンチバルブに挿入されていることを確認してください。 (次の列に培地を分配するためのブレーキのようなこの作品)。
  5. 時〜50のdH 2 Oをオートクレーブ1%の漂白剤の添加、および80%エタノール、いずれかを使用して渡すことで調剤針を滅菌し、廃棄物の解決策を収集するプラットフォーム上でヒントボックスのふたをする。滅菌後は、ボトル、蓋とシリコンチューブで構成される他のセットに変更。
  6. 〜300 mLの培地瓶に詰める。洗浄工程からの残りのエタノールを取り除くために介して培地十分な実行。チューブは洗浄されると、プラットフォーム上で384分の96ウェルプレートをロードする。お皿を埋めるために、"スタート"を押して、各ウェルを準備LBブロス200μlので埋めなくてはなりません。調剤針をクリーニングするには、通過の80%エタノールを約50 mLを実行します。
    注意:あなたのウェルプレートに充填する前にラベル付けされていることを確認してください。

パート2:コロニーのピッキングロボットのセットアップ

  1. 我々はロボットQPix2交流を摘みクローンを使用しているユーザーマニュアルで割り当てられます。ユーザーは、自分のロボットを扱う方法と、最高のピッキング効率を保証するためにすべてを設定するには精通している必要があります。
  2. クローンピッキングエリアの周りに無菌環境を作成するには、30分間UVライトをオンにします。 UVライトがオンになっている間、1%の漂白剤500mLの、無菌のdH 2 Oおよび500mLの80%エタノール500mlを準備する。ラベルとしてUV光がシャットダウン時にオフトレイをいっぱいに。常に正しくラベル付けソリューショントレイにソリューションを注ぐ。背面から前面へ前面トレイにしてオートクレーブのdH 2 Oおよび80%エタノール、1%の漂白剤で埋める。彼らは完全であることを確認してください。ピッキング針は、十分な洗浄溶液なく適切に洗浄することができます。
    注:時間をかけてモニターの80%エタノール。それは蒸発し、補充する必要があるでしょう。
  3. 最適なピッキングのためのパラメータを設定したら、フォスミドクローンとQ - PIXの作業領域内のポストの間にウェルプレートを用いてプリペアド寒天プレートを置きます。あなたがすべての板がオフカバー撮影したことを確認してください!
  4. プレートが右前方の角にしっかりはずなので、ピッキング中に移動することはできません。次にフロントパネルを閉じます。
    注:これは非常に重要です!
  5. 一度、すべてのパラメータは、ピッキングの手順を開始することができます設定されています。すべてのピッキングが完了すると乾燥するためにベンチに脱イオン水とセットでブラシとトレイを洗う。発生した可能性のある流出をクリーンアップ、および80%エタノールでQ:PIXの内側を拭いてください。

パート3:一晩インキュベーションし、ライブラリのストレージ

  1. すべてのグリセロールストックプレートがラベル付けされていることを確認し、そして24時間、37℃のインキュベーターに置いてください。日付、インキュベートプレートの数が、インキュベーションの時間、除去するための時間とあなたのイニシャルを含むインキュベーターでメモを残す。
  2. 長い時間の貯蔵の場合は、-80℃の冷凍庫に成長して一晩インキュベーションを置く。

代表的な結果:

提示プロトコルは、特定の生息地での微生物群集の遺伝的内容をキャプチャする環境フォスミドライブラリを生成する方法について手順を説明します。このプロトコルは、サンプリングされた環境の遺伝的内容の代表であるフォスミドライブラリーを作成する必要がありますし、全体の手順の最後に得られたフォスミドクローンの量が低すぎると読者は重要なステップを変更し最適化するために有効にする必要があります。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

手順は、最も効率的に沿岸水のサンプルに由来するゲノムDNAを持つ大規模挿入フォスミドライブラリを生成する方法を説明しています。アップストリームゲノムDNAの抽出は、別々のプロトコル[3]に記述されています。

フォスミドライブラリとしての生産は、すべての4つ表示される手順を含む、全体の手続きに間に合うように多段階のプロセス、計画は少なくとも2〜3週間です。ゲノムDNAの抽出は、最も重要なステップであると、すべてのダウンストリームの手順は、抽出されたゲノムDNAの質と量に依存しています。ため、このステップのために十分な時間を費やして検討し、慎重に作業。あなたの抽出されたDNAの質と量の制御は非常に重要です。これはあなたが作るしようとしている最初のライブラリの場合は特にそれは、フォスミドクローンの数が少ないことが起こり得ます。自体はフォスミドライブラリーの構築がまっすぐなので、故障は、主に不十分な品質及び/またはあなたの抽出精製したゲノムDNAの量によって引き起こされます。ゲノムDNAを再抽出し、図書館の建設が成功しなかった場合、精製およびDNA -回復に関連するステップに特別な注意を払うことを検討してください。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

私は、開示に何もない。

Acknowledgments

我々は、沿岸と外洋水の低酸素領域で進行中の研究を支援するためのイノベーション、ブリティッシュコロンビア州の知識開発基金と国立科学およびカナダの工学研究審議会(NSERC)のためのカナダの財団に感謝の意を表します。 MTとSLは、微生物の多様性と進化(CMDE)用トゥーラ基礎資金センターからの奨学金によってサポートされていました。 MTはまた、ドイツ学術振興協会(DFG)から奨学金の支援を受けた。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Step II
CopyControl™ Fosmid Library Production Kit Epicentre Biotechnologies CCFOS110 sufficient to generate 9-10 fosmid libraries
SeaPlaque Agarose Cambrex 50100
stirring hot plate Corning PC-420D
1.0X TAE running buffer
CHEF Mapper XA pulsed field electrophoresis system including cooling module and variable speed pump Bio-Rad
λ DNA-HindIII Digest New England Biolabs N3012S
MidRange I PFG Marker New England Biolabs N3551S
10,000X SYBR Gold Invitrogen S11494
microwavable plastic wrap Saran premium wrap
Safe Imager transilluminator Invitrogen S37102
GELase Agarose Gel-Digesting Preparation Epicentre Biotechnologies G09100
scalpel Fisher Scientific 08-927-5D
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane EMD Millipore UFC801024
Microcon YM-30 Centrifugal Filter Unit EMD Millipore 42410
nuclease free water Ambion AM9932
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit *2000 assays*# Invitrogen P7589
digital dry block heater VWR international 12621-088
water bath VWR international 14231-854
centrifuge Beckman Coulter Inc. Avanti J-E
centrifuge rotor Beckman Coulter Inc. JA 5.3
table top centrifuge Eppendorf 5415D
microcentrifuge tubes, 1.7 mL, clear Axygen Scientific MCT-175-C
15 mL centrifuge tubes Fisher Scientific 430052
Step III
LB broth Fisher Scientific BP 1426-2
MgSO4 Sigma-Aldrich M2643
phage dilution buffer 10 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2
cryogenic vials Fisher Scientific 430488
Step IV
96 well plate with lid Fisher Scientific CS003370(3370)
384 well plate with lid Fisher Scientific 07201157(3680)
Petri dishes 100 O.D. x 15mm H Fisher Scientific 08-757-12
Petri dishes 150 Dia. x 15mmH Fisher Scientific 08-757-14
BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mm VWR international CABD351040
glycerol Sigma-Aldrich G5516
chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
LB broth Fisher Scientific BP 1426-2
Difco Agar BD Biosciences 214530
glass beads Fisher Scientific 10-310-1
QFill3 Genetix X3050
Bleach Javex
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
15 mL centrifuge tubes Fisher Scientific 430052
QPix colony picker Genetix QPix2
picking head (E. coli) Genetix X4006

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. Seawater sampling and. J Vis Exp. (2009).
  2. Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
  3. Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation. J Vis Exp. 31, 10-3791 (2009).
  4. Stein, J. L., Marsh, T. L., Wu, K. Y., Shizuya, H., DeLong, E. F. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J. Bacteriol. 178, 591-599 (1996).
  5. Béjà, O., Suzuki, O., Koonin, M. T., Aravind, E. V., Hadd, L., Nguyen, L. P. A., Villacorta, R., Amjadi, M., Garrigues, C., Jovanovich, S. B., Feldman, R. A., DeLong, E. F. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ. Microbiol. 2, 516-529 (2000).
  6. DeLong, E. F., Preston, C. M., Mincer, T., Rich, V., Hallam, S. J., Frigaard, N. -U., Martinez, A., Sullivan, M. B., Edwards, R., Brito, B. R., Chisholm, S. W., Karl, D. M. Community genomics among stratified microbial assemblages in the Ocean's interior. Science. 311, 496-503 (2006).
  7. Hallam, S. J., Putnam, N., Preston, C. M., Detter, J. C., Rokhsar, D., Richardson, P. M., DeLong, E. F. Reverse methanogenesis: testing the hypothesis with environmental genomics. Science. 305, 1457-1462 (2004).

Comments

3 Comments

  1. Awesome and very detailed protocol. I like it!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 26, 2009 - 8:04 PM
  2. Dear Dr. Hallan,
    I am a researcher working at the Environmental Microbiology Laboratory in the National Patagonian Research Center, Argentina. We are just about to start with the preparation of a metagenomic fosmid library from marine sediments, using Epicentre Copy Control kit. We tried the protocol exactly as the manufacturer suggests, performing only ligation and packaging controls before we start with our DNA. Our packaging efficiency was about 10 e 8, but no colonies appeared in the ligation control reaction. I read your JoVE paper, and as your protocol dŒs not involve so much dilution as Epicentre dŒs (they recommend diluting the lambda packages to 1 ml and then the plating dilution again 1:1000), we suspected some kind of problem.
    Have you performed the titering of a ligation control in your conditions? we would like to know the titer and efficiency if you have got this data, as it would greatly help us in our next steps (we want to try the control ligation in your conditions).
    thanks in advance for your time,
    sincerely
    Mariana Lozada

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 9, 2010 - 10:05 PM
  3. I enjoyed your protocol, as it was good to see a demonstration of Epicentre's long fosmid cloning protocol. However, the video says that for colony picking you fill the plate with LB + chloramphenicol + 10% glycerol, but the text says ²0%. Having printed out the protocol and generating our own pCC1FOS, we proceeded to pick ~1000 colonies by hand and transferred them to 96 well plates containing LB + 1².5 µg/ml chloramphenicol + ²0% glycerol. You can imagine the level of disappointment when we pulled the plates out of the 37 degree C room after ²4 hours with absolutely no growth in any of the wells. I just hope that this dŒs not happen to anybody else.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2011 - 12:25 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics