मेल QD झल्लाहट और Microfluidics वास्तविक समय में डीएनए स्व विधानसभा Nanocomplex मॉनिटर करने के लिए

Biology
 

Summary

हम nanophotonics (QD - झल्लाहट) और microfluidics के एक उपन्यास और शक्तिशाली एकीकरण वर्तमान polyelectrolyte पॉलीप्लेक्सेस है, जो भविष्य न्यूक्लिक एसिड आधारित चिकित्सा विज्ञान के लिए बेहतर नियंत्रण और वर्दी और अनुकूलन पॉलीप्लेक्सेस के संश्लेषण प्रदान करने के लिए उम्मीद है के गठन की जांच की.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ho, Y., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time. J. Vis. Exp. (30), e1432, doi:10.3791/1432 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

जीनोमिक्स के क्षेत्र में अग्रिम है कि सेलुलर और आणविक स्तर पर रोगजनन लक्षित कर सकते हैं चिकित्सा विज्ञान के विकास के ईंधन के लिए जारी है. आमतौर पर सेल के अंदर कार्यात्मक, न्यूक्लिक एसिड आधारित चिकित्सा विज्ञान को एक कुशल intracellular वितरण प्रणाली की आवश्यकता है. एक व्यापक रूप से अपनाया दृष्टिकोण है एक जीन वाहक electrostatic आत्म विधानसभा के माध्यम से nanocomplexes फार्म के साथ जटिल डीएनए, डीएनए के सेलुलर तेज की सुविधा है जबकि यह गिरावट के खिलाफ की रक्षा. चुनौती कुशल जीन वाहकों के तर्कसंगत डिजाइन में निहित है, के बाद से समय से पहले हदबंदी या पीढ़ी स्थिर बाध्यकारी सेलुलर तेज और चिकित्सीय प्रभावकारिता के लिए हानिकारक होगा. थोक मिश्रण द्वारा संश्लेषित Nanocomplexes intracellular unpacking और तस्करी व्यवहार है, जो nanocomplexes के आकार और स्थिरता में विविधता के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था की एक विविध रेंज से पता चला है. इस तरह की विविधता आत्म विधानसभा कैनेटीक्स के सटीक आकलन hinders और अभिकर्मक क्षमता या bioactivities उनके भौतिक गुणों correlating में कठिनाई के लिए कहते हैं. हम लामिना का प्रवाह के तहत स्वयं विधानसभा nanocomplex के वास्तविक समय कैनेटीक्स विशेषताएँ nanophotonics (यानी QD झल्लाहट) और microfluidics के एक उपन्यास अभिसरण उपस्थित थे. QD झल्लाहट आणविक संश्लेषण की प्रक्रिया के दौरान और मात्रात्मक उपाय बातचीत की शुरुआत के एक बेहद संवेदनशील संकेत प्रदान करता है, जबकि microfluidics एक अच्छी तरह से नियंत्रित microenvironment spatially उच्च अस्थायी समाधान (~ मिसे) के साथ प्रक्रिया का विश्लेषण प्रदान करता है. Polymeric nanocomplexes के मॉडल प्रणाली के लिए, आत्म विधानसभा की प्रक्रिया में दो अलग - अलग चरणों इस विश्लेषणात्मक मंच द्वारा कब्जा कर लिया गया. आत्म विधानसभा की प्रक्रिया की गतिज पहलू microscale में प्राप्त विशेष रूप से microreactor आधारित प्रतिक्रियाओं जो कई सूक्ष्म और नैनो पैमाने पर आवेदन करने के लिए प्रासंगिक हैं के लिए मूल्यवान होगा. इसके अलावा, nanocomplexes microfludic उपकरणों के उचित डिजाइन के माध्यम से अनुकूलित किया जा सकता है, और जिसके परिणामस्वरूप QD झल्लाहट polymeric डीएनए nanocomplexes संरचना समारोह संबंधों की स्थापना के लिए आसानी से लागू किया जा सकता है.

Protocol

डीएनए की ए Biotinylation

प्लास्मिड डीएनए covalently guanine विशेष बायोटिन के रूप में निर्माता द्वारा वर्णित (Mirus जैव, मैडिसन, WI) लेकिन ~ 1-2 डीएनए प्रति बायोटिन लेबल पहुंचा लेबल के साथ biotinylated थे. प्लास्मिड डीएनए (pEGFP-C1, 4.9 केबी, Clontech, माउंटेन व्यू, सीए) इस प्रोटोकॉल में चिह्नित किया गया.

  1. DNase मुक्त और RNase मुक्त ते बफर (आणविक जीव विज्ञान ग्रेड गुणवत्ता) पानी में pDNA के वांछित राशि को भंग करने के लिए एक 1μg/μL डीएनए समाधान बनाने के लिए.
  2. आचरण लेबलिंग प्रतिक्रिया निम्नलिखित प्रतिक्रिया मिश्रण का उपयोग. लेबल आईटी अभिकर्मक पिछले जोड़ें.

100μg डीएनए प्रतिक्रिया के लिए:

DNase मुक्त और RNase मुक्त पानी 75 μL
10X लेबल बफर एक 20 μL
1μg/μL डीएनए 100 μL
आईटी अभिकर्मक लेबल 5 μL
कुल मात्रा 200 μL
  1. 37 पर प्रतिक्रिया ° सी 1 घंटे के लिए सेते हैं.
  2. शुद्ध इथेनॉल या मानक प्रोटोकॉल का पालन isopropanol तेज़ी से लेबल नमूना.

नोट: जेल निस्पंदन आधारित स्तंभों को उच्च यूवी absorbance या प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि, जो डीएनए की मात्रा का ठहराव या प्रतिदीप्ति लक्षण वर्णन को प्रभावित कर सकता करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
नोट: biotinylation के स्तर HABA आधारित परीक्षण द्वारा निर्धारित किया जा सकता है.

Cy5 - Cationic पॉलिमर के बी लेबल

Chitosan (390 केडीए, 83.5% deacetylated, Vanson, रेडमंड, WA) इस अध्ययन में एक मॉडल cationic बहुलक के रूप में इस्तेमाल किया गया था. chitosan बहुलक रीढ़ की हड्डी पर मुफ्त प्राथमिक amines Cy5 - एन एच एस (Amersham बायोसाइंसेज, Piscataway, न्यू जर्सी) के साथ लेबल रहे थे.

  1. Cy5 डाई की पूरी संयुग्मन की सुविधा के लिए, Cy5 - एन एच एस के लिए आवश्यक राशि की गणना जैसे कि Cy5 की दाढ़ अनुपात: 200: प्राथमिक amines 1 है.
  2. 6.5 ~ NaOH के अलावा द्वारा chitosan के समाधान के पीएच (25mm एसीटेट बफर में) को समायोजित करें. ध्यान दें कि एनएचएस प्रतिक्रिया बुनियादी पीएच में अधिक कुशल है, लेकिन यहाँ विलेयता chitosan के काम पीएच रेंज सीमा.
  3. जबकि भावप्रवण, धीरे धीरे chitosan के समाधान के लिए एक तरीके से ड्रॉप द्वारा ड्रॉप में Cy5 एनएचएस (1 मिलीग्राम / मिलीलीटर DMSO) की गणना की राशि जोड़.
  4. अंधेरे में मिश्रण कमरे के तापमान पर रातोंरात आंदोलन.
  5. शुद्ध करने के लिए, 1% अंधेरे में कमरे Temp पर एसीटेट बफर के खिलाफ 2 घंटा के लिए 10k MWCO स्लाइड - एक Lyzer (पियर्स) के साथ dialyze.
  6. बफर और अंधेरे में कमरे Temp पर एक और 2 घंटा dialyze बदलें.
  7. बफर और 4 में रात dialyze ° सी अंधेरे में बदलें.
  8. स्टोर शुद्ध -20 डिग्री सेल्सियस पर बहुलक लेबल

नोट: इस अध्ययन में, एक मानक वक्र 670 एनएम Cy5 - एनएचएस एस्टर के उत्सर्जन की तीव्रता को मापने के द्वारा निर्मित है. 670 एनएम Cy5 लेबल chitosan से मानक वक्र में प्राप्त उत्सर्जन को मापने के द्वारा लेबलिंग घनत्व विशेषताएँ. Absorbance भी लेबलिंग दक्षता का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है लेकिन यहाँ प्रदर्शन किया गया था नहीं.

QD लेबल डीएनए और Cy5 पॉलिमर सी. तैयारी

pDNA की दाढ़ QD अनुपात अधिक में रखा गया था (pDNA: QD ≈: 1 2) QDs का पूरा pDNA संयुग्मन सुनिश्चित करने के लिए. प्रत्येक pDNA पर लेबल QDs की संख्या इमेजिंग मंदिर या अन्य समकक्ष सुविधाओं के माध्यम से अनुमान लगाया जा सकता है. हमारे अध्ययन में, pDNA प्रति QDs की संख्या होने का अनुमान है ~ मंदिर और एक अणु स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा 1-3 1 का प्रयोग करें Millipore मिल्ली क्यू तैयारी के दौरान ढाल पानी (> 18.0 मेगावाट, 0.2um फ़िल्टर).

  1. Chitosan के लिए आवश्यक राशि 10μg pDNA के लिए वांछित अनुपात एन / पी के अनुसार, chitosan के समाधान में डीएनए समाधान में नकारात्मक फॉस्फेट protonated amines के सैद्धांतिक अनुपात की गणना.
  2. Biotinylated pDNA समाधान में streptavidin functionalized 605QDs (605 Qdot ITK, Invitrogen, Carlsbad, CA के) जोड़ें.
  3. 15 मिनट के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर समाधान सेते हैं.
  4. अंतिम मात्रा 200μL बनाने के लिए 50 मिमी सोडियम सल्फेट समाधान में QD-लेबल डीएनए जोड़ें.
  5. Cy5 chitosan पतला, वांछित अनुपात एन / पी के अनुसार, मिल्ली क्यू पानी के साथ अंतिम मात्रा 200μL बनाने.

नोट: अंधेरे में प्रतिक्रिया के लिए संभव photobleaching को रोकने रखें .
महत्वपूर्ण: Qdot 605 ITK ™ streptavidin संयुग्म (ITK श्रृंखला), के रूप में इस सूची में क्वांटम डॉट्स झल्लाहट के प्रयोजन के लिए डिजाइन कर रहे हैं का उपयोग करने के लिए सावधान रहो. नियमित Qdot श्रृंखला खूंटी सेलुलर लेबलिंग के लिए विशेष रूप से गैर विशिष्ट बंधनकारी, को रोकने के परत के साथ संयुग्मित कर रहे हैं. हालांकि, इस अतिरिक्त कोटिंग दूरी दाता स्वीकर्ता मायनों में इजाफा होगा, r में जिसके परिणामस्वरूपऊर्जा स्थानांतरण क्षमता educed.

डी. निर्माण SU-8 मानक Photolithography का प्रयोग मास्टर्स

  1. सी वफ़र पिरान्हा साफ और 200 पर डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए बेक किया हुआ है.
  2. नामित 25μm के मालिक मोटाई, स्पिन कोट 2000 rpm पर सी वफ़र पर नकारात्मक (2025 SU-8, Microchem, न्यूटन, एमए) 30 सेकंड के लिए photoresist के लिए.
  3. शीतल 65 के एक रैंप के साथ एक hotplate पर वफ़र सेंकना ° सी / 95 के लिए घंटा डिग्री सेल्सियस
  4. 2 250mJ/cm के लिए एक मुखौटा (सीएडी / कला सेवाएँ, Bandon, या) फिल्म microchannels की डिजाइन से युक्त के माध्यम से यूवी प्रकाश (365nm) के लिए बेनकाब.
  5. प्रदर्शन के बाद 65 साल की एक रैंप के साथ एक hotplate पर वफ़र सेंकना ° सी / 95 के लिए घंटा डिग्री सेल्सियस
  6. वफ़र SU-8 photoresist डेवलपर का उपयोग का विकास करना.
  7. नमूनों वफ़र मुश्किल से 65 साल की एक रैंप के साथ एक hotplate पर पके हुए ° / सी 200 से घंटा डिग्री सेल्सियस 200 ° सी में कम से कम 5 घंटे के लिए वफ़र बनाए रखें, तो धीरे - धीरे वफ़र कमरे के तापमान को शांत.

महत्वपूर्ण: के दौरान क्रमिक ramping SU-8 अन्यथा मास्टर पाक प्रक्रिया के लिए आवश्यक है, SU-8 संरचना सिलिकॉन वफ़र या दरारें से अलग हो सकता है SU-8 संरचना तनाव रिलीज द्वारा प्रेरित किया जा सकता है.

PDMS ई. प्रतिकृति स्वामी और संबंध से कवर ग्लास के लिए मोल्डिंग

  1. SU-8 मास्टर एक वजन नाव में रखा गया है.
  2. मिक्स सिलिकॉन elastomer और इलाज एक 10 में ((dimethylsiloxane) पाली, PDMS, Sylgard 184, डॉव Corning, मिडलैंड, एमआई) एजेंट: 1 अनुपात.
  3. SU-8 मास्टर पर PDMS मिश्रण डालो और बुलबुले को दूर करने के लिए एक निर्वात desiccator में वजन नाव छोड़.
  4. 65 ° सी में 1-2 घंटे के लिए चिकित्सा PDMS.
  5. सी मास्टर मोल्ड से PDMS पट्टी पील.
  6. पंच चैनल inlets और fluidic डिवाइस के आउटलेट.
  7. PDMS पट्टी और कवर ग्लास और इथेनॉल के साथ फिर हवा सूखी साफ.
  8. साफ PDMS पट्टी और कवर गिलास ऑक्सीजन प्लाज्मा (20W 1min के लिए) के साथ समझो.
  9. तुरंत बंधन कवर गिलास के साथ PDMS पट्टी.
  10. 95 पर ° रात भर के लिए सी ओवन में बंधुआ microfluidic चिप छोड़ो.

महत्वपूर्ण: प्लाज्मा उपचार और रातोंरात पाक बढ़ाया संबंध ताकत के लिए आवश्यक हैं.

एफ microfluidic डिवाइस में डीएनए Nanocomplexes के गठन मॉनिटर

  1. पानी के साथ microfluidic चैनल (करने के लिए सुनिश्चित करें microfluidic चैनल के अंदर कोई बुलबुले) अभिकर्मकों लोड हो रहा से पहले प्रयोग के दौरान निर्बाध प्रवाह को सुनिश्चित करने के लिए, भरें.
  2. दो व्यक्ति कांच सीरिंज में QD लेबल डीएनए और Cy5 लेबल chitosan समाधान, वीडियो में वर्णित टयूबिंग के माध्यम से लोड करें.
  3. Microfluidic उपकरणों के दो inlets के साथ टयूबिंग कनेक्ट. प्रक्रिया के दौरान किसी भी हवा परिचय नहीं सावधान रहो. 20nL/min (पीएचडी-2000 सिरिंज पंप, Holliston, एमए) में प्रवाह दर, लामिना का प्रवाह शर्तों के तहत निर्धारित करें.
  4. खुर्दबीन के नीचे microchannels की जाँच करें.
  5. जब प्रवाह (~ 15 से 20 मिनट) स्थिर है, QD की मध्यस्थता झल्लाहट चैनल के केंद्र में मनाया जाना चाहिए.
  6. चैनल के साथ विभिन्न स्थानों पर प्रतिदीप्ति चित्रों (कूल्ड सीसीडी, QImaging, ई.पू., कनाडा) ले लो.
  7. ImageJ और OriginLab साथ छवियों प्रतिदीप्ति विश्लेषण.

चित्रा 1
चित्रा 1. QD-झल्लाहट डीएनए विधानसभा स्वयं Nanocomplexes के शुरू होने के एक संवेदनशील संकेत प्रदान करता है

  1. क्वांटम डॉट मध्यस्थता प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (QD झल्लाहट -), डीएनए और जीन के वाहक के बीच बातचीत की शुरुआत की स्पष्ट का पता लगाने के लिए अनुमति देता है या तो अतिरिक्त या अंतर सेलुलर वातावरण में पॉलीप्लेक्स स्थिरता का एक मात्रात्मक और बेहद संवेदनशील संकेत प्रदान कर सकते हैं. जोड़ी झल्लाहट, 605QD और Cy5, दाता और स्वीकर्ता के बीच वर्णक्रमीय ओवरलैप अधिकतम और संभावित पार बात कम से कम के आधार पर चुना गया था. इस जोड़ी के लिए, Forster दूरी 69.4Å है 3 .
  2. QD-झल्लाहट डीएनए nanocomplexes के विधानसभा स्व. Anionic प्लाज्मिड (pDNA) डीएनए और cationic जीन वाहक (ऊर्जा दाता) QD और Cy5 (ऊर्जा स्वीकर्ता) के साथ लेबल रहे थे, क्रमशः. QD-झल्लाहट nanocomplexes electrostatic जटिल coacervation के माध्यम से गठन किया गया. 488 एनएम पर उत्तेजना होने पर, QD-झल्लाहट की मध्यस्थता Cy5 उत्सर्जन एक कॉम्पैक्ट और बरकरार nanocomplex के गठन का संकेत दिया. निवास समय (टी आर) (x) जो दूरी से जहां दो धाराओं जांच के तहत प्रतिक्रिया की स्थिति, और मतलब प्रवाह गति (v) से मिलने उपाय के अनुसार गणना की जा सकती है . लामिना का प्रवाह की प्रकृति के कारण, मिश्रण केवल इंटरफ़ेस (प्रत्येक छवि के केंद्र) पर जगह लेता है, टी आर के एक समारोह के रूप में बड़े पैमाने पर परिवहन की सटीक गणना की अनुमति. टेम्पोरल संकल्प applie अलग से समायोजित किया जा सकता हैघ प्रवाह दरों. (इनसेट) झल्लाहट मध्यस्थता संकेत इंटरफ़ेस जब मिले दो धाराओं पर तुरंत मनाया गया, यह दर्शाता है कि बाध्यकारी तेजी से गया था, लागू प्रवाह दरों के लिए अनुसार कुछ milliseconds के भीतर होने वाली. स्केलपट्टी: 100μm.

Discussion

  • हमारे काम का महत्व:
    1. QD-झल्लाहट प्रतिक्रियाओं के माध्यम से एक सरल microfluidic चिप के भीतर polymeric वास्तविक समय में डीएनए स्वयं विधानसभा nanocomplex कैनेटीक्स (millisecond संकल्प) की निगरानी के लिए यह पहला प्रयास है.
    2. QD-मध्यस्थता झल्लाहट आणविक मुलाकातों की शुरुआत की और आत्म विधानसभा की प्रक्रिया के दौरान एक बेहद संवेदनशील और मात्रात्मक संकेत प्रदान करता है, जबकि microfluidics एक अच्छी तरह से नियंत्रित microenvironment spatially डीएनए nanocomplex संश्लेषण के दौरान प्रक्रिया का विश्लेषण प्रदान करता है.
    3. microfluidics और nanophotonics के एकीकरण complexation प्रतिक्रियाओं के किसी भी प्रकार की जांच के लिए एक नई और दिलचस्प दृष्टिकोण से पता चलता है.
    4. परिणामस्वरूप QD झल्लाहट polymeric डीएनए nanocomplexes संरचना समारोह संबंधों की स्थापना के लिए आसानी से लागू किया जा सकता है 1,2.

Acknowledgements

अनुदान NIH अनुदान HL89764, NSF अनुदान 0546012, 0730503 और 0725528 द्वारा समर्थन प्रदान किया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SU-8 MicroChem Corp. SU-8 2025
PDMS Dow Corning Sylgard 184
Plasmid DNA Clontech Laboratories pEGFP-C1 4.9 kb, MW = 3.3 x 106
LabelIT Biotin Labeling Kit Mirus Bio LLC MIR 3400 Standard protocol yields labeling efficiency of approximately one label every 20-60 bp of double-stranded DNA, The density of labeling was adjusted in this work.
Streptavidin 605QD Invitrogen Qdot® 605 ITK® Streptavidin Conjugate
Cy5-NHS Ester Amersham PA15101
Chitosan Vanson 390 kDa 83.5% deacetylated
Cover Glass Fisher Scientific 12-545C No. 1; Size: 40 x 22mm
Gastight Glass Syringe Hamilton Co TLL series 50μL to 500μL depending on sample volume
Tygon Tubing Small Parts, Inc. 0.02 ID, 100ft Tygon Tubes Microbore, 0.02 ID, 100ft
Connector Small Parts, Inc. HTX-23R Customized in length of 0.750"
Syringe Pump Harvard Apparatus PHD-2000
CCD QImaging Intensified Retiga Cooled
Microscope Olympus Corporation BX-51 100W mercury arc lamp
ImageJ National Institutes of Health v1.36b http://rsb.info.nih.gov/ij
Origin Pro8 OriginLab Student Version
Microscope Filter sets Omega Optical 475AF40 Excitation filter in both channels
Microscope Filter sets Omega Optical 595AF60 Emission filter in 605QD channel
Microscope Filter sets Omega Optical 670DF40 Emission filter in QD-FRET channel
Microscope Filter sets Omega Optical 500 DRLP Long pass dichroic in 605QD channel
Microscope Filter sets Omega Optical 595DRLP Long pass dichroic in QD-FRET channel

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET. J Control Release. 116, 83-89 (2006).
  2. Chen, H. H. Quantitative comparison of intracellular unpacking kinetics of polyplexes by a model constructed from quantum dot-FRET. Mol. Ther. 16, 324-332 (2008).
  3. Zhang, C. Y., Yeh, H. C., Kuroki, M., Wang, T. H. Single-Quantum-Dot-Based DNA Nanosensor. Nat Mat. 4, 826-831 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics