Antikropp Profilering av luciferas Immunoprecipitation Systems (LIPS)

Biology
 

Summary

De tekniska aspekterna av att utföra LIPS (luciferas Immunoprecipitation Systems) beskrivs. Den övergripande strategin innebär att uttrycka chimär gener som kodar för antigener smält till Renilla luciferas (RUC) i däggdjursceller. Rå Ruc-antigen extrakt är då förberedda och utan rening, anställd immunoprecipitation analyser för att kvantifiera antikroppar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Burbelo, P. D., Ching, K. H., Klimavicz, C. M., Iadarola, M. J. Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS). J. Vis. Exp. (32), e1549, doi:10.3791/1549 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Teknik för övergripande förståelse och kvantifiering av antikroppar profiler autoantigener och smittämnen kan ge nya insikter om sjukdomsmekanismer och kan belysa nya markörer för att substratify sjukdom med olika kliniska funktioner och bättre förstå patogenes. Vi har utvecklat en mycket kvantitativ metod som kallas luciferas Immunoprecipitation Systems (LIPS) för profilering patientsera antikroppssvar autoantigener och patogen antigener i samband med infektion. Till skillnad från Elisa-test är mycket känsliga läppar lätt genomförts för att kartlägga humorala serologiskt svar profiler till olika antigener i ett universellt format och producerar ett dynamiskt antikroppstiter områden upp till 6 log

Protocol

1. Schematisk översikt:

Denna video visar de olika stegen i utförandet av LIPS-analysen. Antigener uttrycks i Cos1 celler som rekombinant Renilla luciferas (RUC)-antigen fusioner och råa extrakt framställs och används utan rening. LIPS analys initieras genom inkubering crud e Ruc-antigen extrakt med patient sera i mikrotiter brunnar. Den antikropp-antigen blandningen överförs sedan till en 96-väl filterplattan innehåller protein A / G pärlor att fånga IgG-molekyler. Efter tvättning filterplattan innehåller protein A / G pärlor, antikropp bunden Ruc-antigen genom tillsats av coelenterazine substrat och enheter ljus mäts med en luminometer.

DEL 1: transfektion av Plasmids för produktion av Renilla-Antigen fusionsproteiner

Set-up: Cos1 celler odlas i DMEM-10% FCS med standardprotokoll vävnadskultur. Plasmider för Renilla luciferas fusioner har beskrivits tidigare 1. DNA för dessa plasmider är beredd att använda ett Midiprep kit från Qiagen. Avkastningen bör vara ungefär 1 -3 mg. Mät DNA-koncentration och lagrar som en 1000 mikrogram / ml stamlösning vid -20 ° C.

Förfarande:

  1. En dag innan transfektion, split Cos-1 celler i nya 100 x 20 mm rätter på ca 2 X 10 6 per platta och inkubera vid 37 ° C.
  2. Dagen därpå ska Cos-1 celler 80-95% konfluenta. Etikett 1,5 ml polypropylen mikrofugrör rör för varje plasmid-DNA till transfekterades. Låt FuGENE-6 transfektion reagens, som förvaras vid 4 ° C, värmas upp till rumstemperatur.
  3. Tillsätt 94 ìl av Opti-MEM media till varje mikrofugrör. Tillsätt därefter 6 ìl FuGENE 6 till Opti-MEM media utan att röra sidovägg.
  4. Inkubera blandningen i 5 minuter i rumstemperatur.
  5. Lägg 1-2 mikrogram (från 1mg/ml DNA lump) av plasmiden för Renilla luciferas antigen fusion konstruktion. Blanda och sedan inkuberas blandningen i 15 minuter i rumstemperatur.
  6. Överför DNA-FuGENE 6-Opti-MEM lösning på cellerna genom droppade det jämnt i medierna av Cos1 celler.

DEL 2: Skörd Renilla-antigen Fusions

  1. Två dagar efter transfektion, är de Cos-1 celler skördas. Detta initieras genom att ta bort media och sedan skölja cellerna med 6 ml PBS. Efter dekantering PBS, pipett bort eventuella rester av PBS från vävnadsodling skålen.
  2. Tillsätt 1,4 ml kall lyseringsbuffert består av 50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mm MgCl 2, 1% Triton X-100, 50% glycerol och proteashämmare (2 tabletter av kompletta miniprotease hämmare cocktail per 50 ml lyseringsbuffert). Harvest celler med en cell Scrapper och snabbt överföra hälften av lysat vardera till två 1,5 rör ml mikrofugrör på is.
  3. En Branson Sonifier 150 används för att bryta celler öppna. Placera mikrocentrifugrör innehåller cellen lysat på is och puls i 5 sek, 5 sek och 5 sek med sonication inställningar av 2, 2 och 4, respektive.
  4. Centrifugera cellen lysat vid 12.500 rpm för två 4 minuter snurrar vid 4 ° C. Efter första spin, vänd försiktigt rören för att ta bort löst bifogade skräp från sidoväggen av röret. Efter den andra spin försiktigt Överför supernatanten, utan att störa pelleten, från de två rören till en ny mikrofugrör på is.
  5. Beräkna ljuset enheter (DE) per ìl lysat. För att mäta LU, späd 1 ìl lysat med 8 l PBS i en ny mikrofugrör. Direkt lägga till 100 l 1X coelenterazine substrat till den utspädda blandningen och omedelbart mäta luminiscens i röret med hjälp av ett rör luminometer (20/20 n Turner vetenskapligt) med en 5 sekunders läsa.
  6. Förvara Ruc-antigen lysat vid -20 ° C i 1-2 dagar eller butik för längre tider i alikvoter vid -80 ° C.

DEL 3: Förbereda en Sera Mästare tavla

  1. Gör ett serum mästare tallrik genom att först lägga 450 l av buffert A (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mm MgCl 2, 1% Triton X-100) i varje brunn på en 96-djup-och polypropylen mikrotiterplattan . I detta steg kan ett färgämne, Fenolrött, också att finnas i buffert A (slutlig koncentration är 0,2 mikrogram / ml i buffert A) för att fungera som ett spårämne för att övervaka framtida serum tillsats av provet och andra åtgärder på läpparna analysen.
  2. Tillsätt därefter 50 ìl av serum från varje prov till de olika brunnar med 450 l av buffert A. Obs detta är en 1:10 spädning av serum i buffert A. Normalt serum läggs inte till de sista två brunnar av befälhavaren plattan eftersom Detta är reserverad för bufferten blanksteg.
  3. Innan du använder befälhavaren plattan, är det i stor utsträckning skakas (1-2 timmar) på en rotator plattform. Serumet i master plattan staBLE i minst 1 månad (eller längre) vid 4 ° C, om den förvaras på rätt sätt för att förhindra avdunstning.
  4. Som beskrivs nedan, ger denna mästare tallrik 10 ìl av utspätt serum som ska upprepade gånger bort för profilering av serum mot flera antigener. Större och mindre behärska plattor kan också användas. Täta plattan bra med Parafilm när den inte används.

DEL 4: LIPS assay

  1. Polypropylen 96-grunt väl mikrotiterplattor används för att testa serum. I det första steget, tillsätt 40 ìl av buffert A till varje brunn på 96-brunnar med hjälp av en 8 kanals mikropipetten.
  2. Nästa tar 10 ìl utspätt serum (1 l serum motsvarande) från befälhavaren plattan och lägg till det direkt i varje brunn i arbetsgruppen plattan med hjälp av en 8 kanals mikropipetten.
  3. En Master Mix med RUC-antigenet utdraget nästa utformas så att 1 x 10 7 ljus enheter (LU) läggs i 50 ìl av buffert A till varje brunn. Lägre ingångar (så lite som 1 x 10 6) kan också användas, men resulterar i ett lägre dynamiskt omfång. Gör detta mästare blandningen och pipett 50 ìl Ruc-antigen blandning i varje brunn.
  4. Inkubera plattan på en rotationsskak under 1 timme i rumstemperatur.
  5. Under inkubationen, tillsätt 5 ìl av en 30% suspension av ULTRALINK protein A / G pärlor (Pierce Bioteknik, Rockford, IL) i PBS till botten av varje brunn i en ny 96 och filtret HTS platta (Millipore, Bedford, MA) .
  6. Efter 1 timme inkubation, överföra 100 l Ruc-antigen blandning antikroppsreaktion till 96 och filtrera HTS plattor som innehåller protein A / G pärlor med hjälp av en 8 kanals mikropipetten.
  7. Inkubera 96-bra filterplattan på en rotationsskak för en extra timme i rumstemperatur.
  8. Därefter tvättas filtret plattan på ett vakuum fördelare. Varje brunn tvättas 8 gånger med 100 ìl Buffer A, följt av två gånger med 100 l PBS. Detta kan utföras manuellt eller med en robot pipettera arbetsstation.
  9. Efter den sista tvättningen är vakuum avstängd. Ta bort filtret plattan och blot det torrt med en bunt pappershanddukar eller filterpapper och se till att avlägsna fukt på toppen och botten av plattan.

DEL 5: Mätning Luminescence och dataanalys

Set-up:

En Berthold LB 960 Centro mikrotiterplatta luminometer används för att bestämma luminiscens i varje brunn med en enda spridare. När maskinen är påslagen, skölj injektorn med destillerat H 2 O med injektorn tvättprogram. Coelenterazine substrat är beredd att använda Promega kitet Renilla substrat som beskrivs av tillverkaren. Normalt 6 ml 1X coelenterazine substrat mix (dvs 60 l coelenterazine lager plus 6 ml 1X buffert) är förberett för grundmålning maskinen och kör en full 96-brunnar. Innan analysera plattan är Berthold LB 960 Centro mikroplattan luminometer primas med 1X coelenterazine substrat. Öppna ett program fil som innehåller inställningen för att injicera substrat och läsa plattan. För dessa mätningar är 50 ìl av coelenterazine substrat injiceras är plattan skakas i 2 sek, följt av en 5 sek läsa av luminiscens.

  1. Även om plattan luminometer har kapacitet att läsa hela plattan, kan en partiell läsa av plattan också väljas (under läs-menyn). Starta programmet, som initierar läsning av plattan.
  2. Efter körningen, ta bort plattan mikroteststrips filtret snabbt för att förhindra spill i luminometer. Exportera data som genereras med MikroWin programmet till en Excel-format för analys.
  3. Vi rekommenderar att utvärdera serum från två oberoende körningar. Uppgifterna används sedan i genomsnitt för att generera LU titer värden för varje prov. Dessa värden kan ytterligare anpassas till subtrahera buffert blanksteg.
  4. Ytterligare analys av data, såsom att bestämma gränsvärdet kan beräknas genom att ta medelvärdet plus 3 eller 5 standardavvikelser av kontrollen värden.

Discussion

LIPS kräver minimal analys optimering och på grund av sin enkelhet, kan data av hög kvalitet normalt genereras med LIPS på under två veckor för en viss antigen. Den mest tidskrävande stegen är kloning och genererar lämpliga plasmiden uttrycket vektor som innehåller RUC-antigen fusion. När dessa plasmider genereras, kan en eller flera antigener snabbt testas med LIPS som beskrivs ovan. Det bör noteras att LIPS är ganska mångsidig så att sera även kan testas i ett rör format eller alternativt på en mikrotiter filterplattan med hjälp av en BIOMEK robot arbetsstation 2 eller en tallrik bricka med vakuumfiltrering. Denna mycket skalbart system möjliggör parallella LIPS profilering av en panel av mänsklig autoantigener 3 eller hela proteomet av ett virus 4. Det är troligt att många olika antikroppar profiler som genereras av LIPS kommer att vara användbart för diagnostik 3-9, antigen upptäckt 9, efter loppet av en behandling 10, vaccin övervakning och har stora återverkningar för specifika sjukdomstillstånd och för folkhälsan i allmänhet.

Acknowledgements

Denna forskning stöds av Interna forskningsprogram NIDCR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HiSpeed Plasmid Midi KIt Qiagen 12643
100 x 20 mm tissue culture dishes Fisher Scientific 353003
Opti-MEM Invitrogen 31985
FuGENE 6 Roche Group 1814443
Complete, Mini protease inhibitor cocktail Roche Group 11836153001
Polypropylene 96 DeepWell 1 ml plate Fisher Scientific 12-566-120 Deep well plate with lid and seal with Parafilm
Polypropylene microtiter plate Fisher Scientific 12-566-120
HTS Filter plate EMD Millipore MSBVN1B50
Ultralink Immobilized Protein A/G Pierce, Thermo Scientific 53133 (10ml)
Renilla Luciferase Assay System Promega Corp. E2820 For 2000 assays
Centro microplate luminometer Berthold Technologies LB 960

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Burbelo, P. D., Goldman, R., Mattson, T. L. A simplified immunoprecipitation method for quantitatively measuring antibody responses in clinical sera samples by using mammalian-produced Renilla luciferase-antigen fusion proteins. BMC Biotechnol. 5, 22-22 (2005).
  2. Burbelo, P. D., Leahy, H. P., Iadarola, M. J., Nutman, T. B. A Four-Antigen Mixture for Rapid Assessment of Onchocerca volvulus Infection. PLoS Negl Trop Dis. 3, e438-e438 (2009).
  3. Burbelo, P. D. Sensitive and robust luminescent profiling of anti-La and other autoantibodies in Sj gren’s syndrome. Autoimmunity. 139, 241-245 (2009).
  4. Burbelo, P. D. Rapid antibody quantification and generation of whole proteome antibody response profiles using LIPS (luciferase immunoprecipitation systems). Biochem Biophys Res Commun. 352, 889-895 (2007).
  5. Burbelo, P. D., Groot, S., Dalakas, M. C., Iadarola, M. J. High definition profiling of autoantibodies to glutamic acid decarboxylases GAD65/GAD67 in stiff-person syndrome. Biochem Biophys Res Commun. 366, 1-7 (2008).
  6. Burbelo, P. D. A new luminescence assay for autoantibodies to mammalian cell-prepared insulinoma-associated protein 2. Diabetes Care. 31, 1824-1826 (2008).
  7. Burbelo, P. D. Serological diagnosis of human herpes simplex virus type 1 and 2 infections by luciferase immunoprecipitation system assay. Clin Vaccine Immunol. 16, 366-371 (2009).
  8. Burbelo, P. D. Highly quantitative serological detection of anti-cytomegalovirus (CMV) antibodies. Virol J. 6, 45-45 (2009).
  9. Burbelo, P. D. Four-antigen mixture containing v-cyclin for serological screening of human herpesvirus 8 infection. Clin Vaccine Immunol. 16, 621-627 (2009).
  10. Ramanathan, R. A luciferase immunoprecipitation systems assay enhances the sensitivity and specificity of diagnosis of Strongyloides stercoralis infection. J Infect Dis. 198, 444-451 (2008).

Comments

2 Comments

  1. I need diagrammatic illustrations on how luciferase immunoprecipitation system can be carried out as related to serological determination of antibodies

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 7, 2010 - 5:41 AM
  2. I need diagrammatic illustrations on how luciferase immunoprecipitation system can be carried out as related to serological determination of antibodies

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 7, 2010 - 5:43 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics