मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं को ठंड और विगलन

Biology
 

Summary

जेम्स थॉमसन एट अल के बाद से 1998 में एक तकनीक विकसित अलग करने और संस्कृति में HES बढ़ने, बाद में उपयोग के लिए और एक जमे हुए स्टॉक से कोशिकाओं विगलन और विस्तार ठंड कोशिकाओं दिनचर्या HES सेल संस्कृति में महत्वपूर्ण प्रदर्शन प्रक्रियाओं बन गए हैं. चूंकि HES कोशिकाओं को ठंड और विगलन के तनाव के लिए बहुत संवेदनशील होते हैं, विशेष ध्यान रखा चाहिए. यहाँ हम तेजी से तरल नाइट्रोजन शेयरों से HES कोशिकाओं विगलन, उन्हें माउस भ्रूणीय फीडर कोशिकाओं पर चढ़ाना, और धीरे धीरे उन्हें लंबी अवधि के भंडारण के लिए ठंड के लिए उचित तकनीक का प्रदर्शन.

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Kent, L. Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (34), e1555, doi:10.3791/1555 (2009).

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Abstract

जेम्स थॉमसन के बाद से

Protocol

1. विगलन HES कोशिकाओं

पूर्व प्रयोगात्मक सेट अप

  1. एक दिन पहले विगलन HES कोशिकाओं, विकिरणित माउस भ्रूणीय (MEF) fibroblasts, CF1 तनाव, जिलेटिन लेपित MEF संस्कृति माध्यम में 6 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति की थाली (डी सदस्य बेसल मध्यम के साथ पूरक की अच्छी तरह से एक पर फीडर परत प्लेट 10% गर्मी निष्क्रिय FBS और 1% गैर आवश्यक अमीनो एसिड). 37 पर रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2.
  2. तरल नाइट्रोजन से HES कोशिकाओं को हटाने से पहले, जगह में सभी आवश्यक उपकरण और अभिकर्मकों है यकीन है और एक कुशल और सफल पिघलना सुनिश्चित करने के लिए उपयोग करने के लिए तैयार हो.

HES कक्ष विगलन

  1. तरल नाइट्रोजन भंडारण टैंक धातु संदंश का उपयोग कर से HES कोशिकाओं का एक क्रायोजेनिक शीशी निकालें.
  2. 3-5 सेकंड के लिए gloved हाथों के बीच शीशी रोल ठंढ हटायें.
  3. शीशी के लेबल पर जानकारी का रिकार्ड.
  4. धातु संदंश का प्रयोग, एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में शीशी विसर्जित कर दिया. भंवर धीरे शीशी और पिघलना की प्रगति अक्सर निरीक्षण (जल्दी लेकिन!) शीशी धारण प्रकाश बर्फ क्रिस्टल के आकार को देखने के द्वारा. पानी के स्नान में शीशी टोपी डूब के रूप में यह कोशिकाओं को दूषित सकता है मत करो.
  5. जब केवल एक छोटा सा बर्फ क्रिस्टल रहता है, डूब इथेनॉल में पूरे शीशी के लिए बाँझ.
  6. एक बाँझ जैविक सुरक्षा कैबिनेट में, सीधे एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब के नीचे क्रायोजेनिक शीशी की सामग्री हस्तांतरण.
  7. धीरे धीरे HES सेल संस्कृति माध्यम से 4 एमएल (D-MEM/F-12 बेसल मध्यम 20% नॉकआउट सीरम प्रतिस्थापन, 1% गैर आवश्यक अमीनो एसिड, 1 एल glutamine%, 0.2% β - mercaptoethanol और 4 / एनजी के साथ पूरक जोड़ें एमएल ट्यूब) bFGF. धीरे लगातार कोशिकाओं मिश्रण नए माध्यम के रूप में ट्यूब के लिए जोड़ा जाता है रॉक.
  8. X 200 जी में 5 मिनट के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र

HES कक्ष चढ़ाना

  1. सेल लाइन, संख्या बीतने, और पिघलना तारीख जबकि HES कोशिकाओं अपकेंद्रित्र में हैं, उपयुक्त HES सेल जानकारी के साथ लेबलिंग MEF फीडर प्लेट तैयार है.
  2. जब वहाँ लगभग 2 मिनट स्पिन समय पर छोड़ दिया है, MEF संस्कृति के माध्यम aspirate और अच्छी तरह से पीबीएस की 1.0 एमएल जोड़ें.
  3. Pelleted HES कोशिकाओं जैविक सुरक्षा कैबिनेट वापस लाओ और ध्यान से सतह पर तैरनेवाला aspirate. सेल गोली नहीं aspirate है, लेकिन हटाने के रूप में बहुत संभव के रूप में सतह पर तैरनेवाला, के रूप में इस ठंड माध्यम से DMSO के समाधान होता है सावधान रहो.
  4. गोली HES सेल संस्कृति माध्यम से 2.5 एमएल जोड़ने 5 एमएल कांच pipet का उपयोग और 3-4 बार pipetting द्वारा बहुत धीरे पुनः निलंबित.
  5. MEF अच्छी तरह फीडर से पीबीएस Aspirate और धीरे धीरे 6 अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से तैयार करने के लिए HES सेल निलंबन के सभी 2.5 एमएल जोड़ने.
  6. 37 ° सी इनक्यूबेटर में थाली प्लेस और ध्यान की ओर से आगे की थाली वापस करने के लिए, और साइड स्लाइड के समान रूप से अच्छी तरह से भर कोशिकाओं वितरित. केंद्र में कालोनियों ध्यान केंद्रित से बचने के लिए एक परिपत्र पैटर्न में थाली ज़ुल्फ़ मत करो.
  7. कोशिकाओं को 37 में संलग्न करने के लिए डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 रातोंरात की अनुमति दें .
  8. पिघलना के बाद दिन, मध्यम हटाने के लिए (किसी भी अस्थायी कोशिकाओं के साथ) और अच्छी तरह से करने के लिए ताजा HES सेल संस्कृति माध्यम के 2.5 मिलीलीटर जोड़ें.
  9. वैकल्पिक: हटा मध्यम और कोशिकाओं एक अलग तैयार MEF फीडर थाली करने के लिए हस्तांतरित किया जा सकता है. यह कदम अक्सर नई कालोनियों कि मूल पिघलना से कोशिकाओं के साथ समानांतर में संवर्धित किया जा सकता है है उत्पन्न करता है.
  10. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ रातोंरात 2 प्लेटों सेते हैं.

2. HES कक्ष बर्फ़ीली

  1. जबकि HES कोशिकाओं अपकेंद्रित्र में हैं, जैविक सुरक्षा कैबिनेट के अंदर क्रायोजेनिक शीशियों सेल लाइन, बीतने संख्या, और ठंड तारीख सहित, लेबल. ठंड HES कोशिकाओं के लिए विशिष्ट घनत्व प्रति क्रायोजेनिक शीशी कोशिकाओं (6 अच्छी तरह से एक थाली से) अच्छी तरह से एक है.
  2. जब HES कोशिकाओं centrifuging खत्म हो रहे हैं, ट्यूब वापस लाने जैविक सुरक्षा कैबिनेट के लिए. ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला Aspirate, शिथिल पैक सेल गोली परेशान नहीं सावधान किया जा रहा है.
  3. 0.5 एमएल प्रति क्रायोजेनिक शीशी HES सेल संस्कृति माध्यम: HES सेल संस्कृति माध्यम की उचित राशि के साथ सेल गोली Resuspend. बहुत कोमल जब pipetting, HES कोशिकाओं के रूप में बेहतर पुनर्प्राप्त जब अपेक्षाकृत बड़ी कॉलोनी टुकड़ों में जमे हुए.
  4. धीरे धीरे, जबकि धीरे ट्यूब मिलाते हुए, कोशिकाओं को 2X HES सेल ठंड मध्यम (60% परिभाषित FBS, 20% HES सेल संस्कृति माध्यम, और 20% DMSO) की उचित मात्रा में (cryovial प्रति 0.5 एमएल) जोड़ने. एक बार ठंड मध्यम जोड़ा है, pipet समाधान बहुत धीरे से एक को दो बार मिश्रण.
  5. जल्दी लेकिन धीरे, प्रत्येक क्रायोजेनिक शीशी के लिए सेल निलंबन के 1 एमएल जोड़ें.
  6. एक isopropanol ठंड कंटेनर और जगह में शीशियों का स्थानांतरण-80 ° सी रात भर फ्रीजर. कोशिकाओं में 1 पर ° isopropanol ठंड कंटेनर में प्रति मिनट सी फ्रीज होगा.
  7. अगले दिन, जल्दी से एक तरल नाइट्रोजन धातु संदंश का उपयोग भंडारण टैंक जमी शीशियों हस्तांतरण.

प्रतिनिधि परिणाम

पहले दिन के बाद मानव ES कोशिकाओं thawed रहे हैं, छोटे कालोनियों पारदर्शी दिखाई देते हैं और खुर्दबीन के नीचे देखना मुश्किल हो सकता है हो सकता है. चूंकि नए thawed ES कोशिकाओं को धीरे धीरे पैदा करते हैं कुछ दिनों के, वे लेने के लिए स्थापित कालोनियों (चित्रा 1) के रूप में प्रकट हो सकता है.

चित्रा 1. सेल वसूली और विकास HES कोशिकाओं. तरल नाइट्रोजन से thawed imaged थे विगलन के बाद 1, 7 और 11 दिन.

Discussion

साथ वीडियो विगलन और ठंड HES कोशिकाओं के लिए एक विधि दर्शाता है. तरल नाइट्रोजन में जमे हुए कक्ष जितनी जल्दी संभव स्नान thawed चाहिए सर्वोत्तम संभव वसूली प्राप्त करने . बहुत सावधान रहना जब विगलन कोशिकाओं pipetting याद रखें: कक्षों की हैंडलिंग कम से कम और धीरे विंदुक. HES कोशिकाओं की एक शीशी या तो 6 अच्छी तरह से, एक थाली या 4 अच्छी तरह से एक थाली के सभी कुओं की एक अच्छी तरह से एक पर चढ़ाया जा सकता है और तुरंत इनक्यूबेटर में रखा है. चार अलग - अलग कुओं में संवर्धन के बाद से संदूषण के लिए पूरी संस्कृति को खोने की संभावना कम कर देता है, और छोटे सतह क्षेत्र पर HES सेल कालोनियों का पता लगाने के लिए यह आसान बनाता है है, 4 अच्छी तरह से थाली जब पहली बार के लिए HES कोशिकाओं का विगलन की सिफारिश की है.

HES कोशिकाओं विगलन के बाद पहले दिन, कालोनियों छोटे हैं और पारदर्शी हो सकता है. HES सेल संस्कृति माध्यम हर दिन पुनर्भरण, भले ही कालोनियों माइक्रोस्कोप के अंतर्गत स्पष्ट नहीं कर रहे हैं क्योंकि यह HES कोशिकाओं के लिए एक संस्कृति में कुछ दिनों लेने के लिए स्थापित कालोनियों के रूप में प्रकट हो सकता है. यह महत्वपूर्ण है के लिए एक नया मढ़वाया MEF फीडर परत का उपयोग करें जब कोशिकाओं विगलन, कालोनियों के रूप में अक्सर पिघलना 10 12 दिनों के बाद जब तक passaging के लिए एक उपयुक्त आकार तक पहुँच नहीं करते.

जब HES कोशिकाओं की एक कम पारित होने शीशी विगलन, यह विस्तार करने के लिए और अतिरिक्त शीशियों को फ्रीज करने के लिए भविष्य की संस्कृति और प्रयोगों के लिए कम बीतने कोशिकाओं के एक शेयर को बनाए रखने अच्छा अभ्यास है. यह भी एक अच्छा विचार के लिए नियमित रूप से सभी "अतिरिक्त" स्वस्थ HES कोशिकाओं को फ्रीज करने के लिए जमे हुए शेयरों को बनाए रखने के लिए है. सबसे सफल thaws और बाद संस्कृतियों उच्च गुणवत्ता, undifferentiated, सक्रिय विभाजन HES सेल कालोनियों के रूप में जमे हुए थे. HES कोशिकाओं और अधिक कुशलता से ठीक एक फ्रीज से अगर बड़ा सेल समुच्चय के रूप में धीरे संभाला. अंतिम कुल आकार (या थोड़ा की तुलना में बड़ा) एक नियमित पारित होने के बाद मढ़वाया समुच्चय के आकार के लिए समान होना चाहिए.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
D-MEM Invitrogen 11965-092 For MEF mediumjavascript:void(0);
Fetal Bovine Serum (FBS), Certified Invitrogen 16000-044 Heat-inactivated
For MEF medium
D-MEM/F-12 Invitrogen 11330-057
Knockout Serum Replacement Invitrogen 10828-028 Pre-screen to ensure support of hES cells
bFGF Stemgent 03-0002 Use at [4 ng/mL] final
Non-essential Amino Acids Invitrogen 11140-050
L-glutamine Invitrogen 25030-081 200 mM (100X)
Use at [1X] final
PBS Invitrogen 14190-250 Without Ca2+ or Mg2+
Collagenase IV Invitrogen 17104-019 Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12
Gelatin Sigma-Aldrich G1890 Type A, Porcine
DMSO Sigma-Aldrich D2560 For freezing medium
Fetal Bovine Serum (FBS), Defined Hyclone SH300.70.01 For freezing medium
6-well plates Nalge Nunc international 140675 For general culture
4-well plates Nalge Nunc international 176740 For thawing
5 mL glass pipettes Fisher Scientific 13-678-27E Individually wrapped
15 mL conical tubes Corning 430052 Polypropylene
Cryogenic vials Nalge Nunc international 5000-1020 1.5 mL capacity
Freezing container Nalge Nunc international 5100-0001 Mr. Frosty”

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References

  1. Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. 5th edition, Wiley-Liss. (2005).
  2. Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, (5391), 1145-1147 (1998).

Comments

5 Comments

  1. How dŒs the different thawing rates(temperatures) might effect the cells?
    Thx,Ted

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 13, 2010 - 10:26 AM
  2. Hi Ted, I think the temps and rates can be linked to cell recovery and viability. I would love to hear some feedback on the CoolCell for for freezing Stem Cells vs the Mr Frosty.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 30, 2010 - 1:47 PM
  3. very nice ,I think more protocolls in video fore , practical for diffrernt techniques will be usefull

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 30, 2010 - 1:11 AM
  4. Could I thaw the cells in an incubator instead of a water bath?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 2, 2011 - 3:18 PM
  5. Any body compared different freezing media for iPSCs? Which one is the best? Thanks.

    Reply
    Posted by: Zongyou G.
    November 26, 2013 - 3:00 PM

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