العزلة وزرع الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs)

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lo Celso, C., Scadden, D. Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs). J. Vis. Exp. (2), e157, doi:10.3791/157 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

مجموع إعداد نخاع العظام

  1. وضحى أربعة B6 تشريح الفئران والحصول على tibias ، femurs ، والورك والعمود الفقري.
  2. خلال التشريح ، يتم الاحتفاظ الأطراف والعظام في الحرارة PBS FCS 2 ٪ المعطل (EDA 2mm والاختيارية -- متوسطة تشريح).
  3. وسحقت عظام نظيفة مع مدقة الهاون والمتوسطة في تشريح. وسيلة فعالة لتحقيق ذلك هو سحق tibias ، femurs والوركين كل فأر ، ثم 2 العمود الفقري في كل مرة.
  4. يبقى الخليط خلية تم الحصول عليها من كل الماوس منفصلة وتصفيتها من خلال تصفية 40μm في أنبوب الصقر 50ml. بهذه الطريقة ، كل أنبوب يحتوي على خليط الخلية التي تم الحصول عليها من جميع عظام الساق على فأرة الحاسوب ، ونصف من خليط من 2 الحصول على العمود الفقري. في هذه المرحلة ، يتم استخدام فلتر لفصل الحطام العظام.
  5. عادة ما يكون من المستحسن لسحق عظام الساق مرتين للحصول على وايت (مع عدم وجود نخاع العظم) شظايا العظام والعمود الفقري وشظايا 2 أو 3 مرات.
  6. تملأ أنابيب ليكون لهم متوازنة ، وتدور 1200rpm 5 دقائق.
  7. نضح في وطاف تخفيف بيليه عن طريق سحب الأنابيب على الرف الأنبوب (هذه الخطوة الهامة بعد كل الطرد المركزي للحد من تشكيل خلية تتجمع والخسارة). Resuspend في كل أنبوب 1 مل PBS FCS 2 ٪ (NO EDTA من الآن فصاعدا) إذا كنت تفعل استنفاد النسب ، أو في ما هو خلاف ذلك حجم مريحة بالنسبة لك.

نسب استنزاف

  1. هذا الإجراء يسمح لك للقضاء على خلايا متباينة للغاية والحصول على مجموعة من السكان غير متجانسة للغاية من الخلايا ، والخلايا الجذعية المخصب لوالسلف. إذا كنت الفرز HSC ، هذه الخطوة تقلل بشكل كبير من عدد من الخلايا التي يجب أن تمر عبر الفرز الخلية ، وبالتالي تقليل وقت الفرز ويسمح لك لفرز HSC من أصل عدد أكبر من الفئران ، وذلك حتى تتمكن من الحصول على عدد أكبر من HSC في واحدة فرز واحد.
  2. إذا كنت تسير على الفرز في وقت لاحق ، واخراج 50μl خليط من الخلية (وأنا عادة ما تأخذ قليلا من كل أنبوب) لفرز عناصر تحكم (غير ملوثين وSca1 ، ج ، كيت ، CD48 ، Flk2 الضوابط لون واحد).
  3. إضافة لين 30ml/tube كوكتيل. كوكتيل يحتوي على نسب مختلفة من الأجسام المضادة ، والذي يتغير للأسف قليلا من المختبر إلى المختبر. في المختبر Scadden ، ونحن نستخدم الأجسام المضادة ضد biotinilated GR1 ، Ter119 ، CD4 ، CD8 ، CD3 ، B220. التخفيف النهائية في تلطيخ هو 1:700.
  4. الدوامة بسرعة إلى المزيج ، واحتضان لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  5. أثناء الحضانة ، وإعداد الأعمدة على المغناطيس وأنابيب شطف 15ml تحت الأعمدة. ديغا بعض PBS باستخدام فلتر steriflip (سترى فقاعات هواء صغيرة تتحرك في اتجاه سطح PBS بسبب الشفط) ، ويوازن الأعمدة من خلال تطبيق برنامج تلفزيوني 3ml degassed إلى كل عمود.
  6. تدفق حوالي 1ml/5min العمود ، لذلك يستغرق نحو 15 دقيقة ليكون جاهزا للاستخدام الأعمدة.
  7. في نهاية الحضانة ، إضافة PBS FCS 2 ٪ لملء الأنابيب وتدور باستمرار لمدة 5 دقائق في 1200rpm.
  8. نضح لطاف ، وتخفف من الكريات resuspend في 1 مل / أنبوب degassed برنامج تلفزيوني.
  9. إذا كنت الفرز في وقت لاحق ، واخراج مجموع النسب نخاع العظم واحد اللون CTRL تلطيخ (15ml ، قليلا من كل أنبوب).
  10. إضافة streptavidin 30ml/tube الخرز ، الدوامة بسرعة إلى المزيج ، واحتضان لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  11. في نهاية الحضانة ، إضافة 2 مل / أنبوب PBS degassed. وضعت مجموعة جديدة أنابيب تحت الأعمدة ، وتطبيق كل تعليق إلى عمود ، والترشيح من خلال مرشح 40μm.
  12. إضافة آخر مل 3 من برنامج تلفزيوني degassed إلى كل أنبوب لغسله. مرة واحدة في أعمدة فارغة ، وتطبيق مرة أخرى باستخدام نفس تصفية 40μm.
  13. ويحتوي على خليط شطافة النسب الخلية المنضب ، بلغ عدد السكان غير متجانسة المخصب لخلايا الجذعية والأسلاف. تجمع مضمون أنابيب 4 في 2 الأنابيب. تدور لمدة 5 دقائق في 1500rpm.
  14. نضح طاف. يجب أن تكون بيضاء أو بيليه الأبيض في المقام الأول. تخفيف الكريات وresuspend معا في برنامج تلفزيوني مجموع 1ml FCS 2 ٪ إذا كنت الفرز في وقت لاحق ، على خلاف ذلك في ما resuspend حجم مريحة بالنسبة لك.

LKS أو طويلة الأجل الفرز HSC

  1. اخراج النسب المنضب لون واحد السيطرة تلطيخ (15ml). هذا سيسمح لك لتقييم كفاءة استنفاد النسب الخاصة بك.
  2. اتسخت الخليط لفرز الخلية في أنبوب 15ml.

إضافة الأضداد :

SCA PE - Cy5.5 1 : 100 10ML
مجموعة APC 1:100 10ML
SA - PE Cy7 1:500 2ml

لفرز HSC المدى الطويل ، إضافة أيضا :

CD48 FITC 1:1000 1ml
Flk2 PE 1:200 5ml

كذلك ، تعد واحدة تلطيخ الضوابط باستخدام نخاع العظم مجموع أبقى جانبا بعد تشريح ونخاع العظم الملون مجموع النسب. ويمكن القيام بهذه stainings مباشرة في أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية.

تأكد من أن تكون في الظلام!

  1. الدوامة بسرعة لخلط واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 20 إلى 30 دقيقة ، في منتصف الطريق من خلال إعادة خلط.
  2. ليغسل فائض من الأجسام المضادة ، تملأ أنابيب مع FCS PBS 2 ٪ و 5 دقائق عن الدوران عند 1500 دورة في الدقيقة.
  3. إزالة طاف ، resuspend جميع الكريات ونقلها إلى أنابيب جديدة مع قبعات FACS التصفية. قد يستغرق بعض الوقت للحصول على الخلايا من خلال الذهاب الى هذه الفلاتر ، وأنه من المهم تطبيق بعض أكثر برنامج تلفزيوني بعد ذلك لغسل تصفية والتقليل من فقدان الخلية. هذه الخطوة كانت ضرورية لتفادي انسداد فارز ، والذي هو أسوأ كابوس لكل مستخدم الخلية فارز.
  4. عندما يوزعون الخلايا إلى الخلية مرفق الفرز ، وتأكد من أن تعد كذلك مع أنبوب مرحبا PBS FCS 10 ٪ حيث سيتم جمع الخلايا.
  5. إذا كنت فرز الخلايا LKS ، سوف تحصل على مجموعة من السكان غير المتجانسة التي تحتوي على المدى الطويل والقصير وإعادة إسكانها الأسلاف HSC multipotent. عائد متوسط ​​300000 LKS من 4 الفئران.
  6. إذا كنت قد استخدمت أيضا CD48 Flk2 والأجسام المضادة ، يمكنك فصل كل السكان من شهادة الثانوية العامة على المدى الطويل ، القصير الأجل وHSC MPP. LT - HSC هم السكان الأكثر نادرة. متوسط ​​العائد على حوالي 50،000 إلى 60،000 في الفترة من 4 خلايا الفئران.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Comments

9 Comments

  1. Hi, Thankyou for the wondeful post. I was working with endothelial progenitor cells and wanted to know how many of the bone marrow cells are Sca-1 positive. Also is it possible that we can extract the BMC and then store them at -²0 and stain them for FACS the next day? Any help will be greatly appreciated. Thanks 

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 31, 2008 - 1:45 PM
  2. You can sort on the following day, but you should keep the cells at 4C, better in an ice bucket in the fridge. Many cells die upon freezing

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 17, 2009 - 10:25 AM
  3. Can you please tell me where you purchased your streptavidin beads? Thank you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 2, 2008 - 12:33 PM
  4. miltenyi

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 17, 2009 - 10:27 AM
  5. How do you isolate muscle tissue from spin bone? And if without specific step to isolate muscle tissue, would the results of FACS be different? BTW. How do you deleption RBC form those bone marrows? Thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 23, 2008 - 4:20 AM
  6. you need to use a scalpel and much patience. LEaving muchmuscle around the spine makes it harder to crush and will reduce your yield.   RBC are depleted while lineage depleting. The post-column pellet is white. I do no recommend a separate RBC lysis because there is the risk it will damage other cells also.Moreover, it is hard to perform it consistently.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 17, 2009 - 10:29 AM
  7. How many HSCs do you inject into the irradiated recipients?

    Reply
    Posted by: Wilma J.
    August 20, 2010 - 11:39 AM
  8. Hi,
    My name is shahid chaudhary and I am working on EAE mice. The only problem i am facing with the experiment is the intravenous injection of genetically modifed HSC into the tail of the mice. I have used lamps but its not helping me out and because of this I am feeling very underestimated while doing the expperiment. Can anyone suggest me some good tips regarding the intravenous tail vein injection. That will be very much grateful.

    Reply
    Posted by: Shahid C.
    December 5, 2012 - 10:30 AM
  9. Hi,
    My name is shahid chaudhary and I am working on EAE mice. The only problem i am facing with the experiment is the intravenous injection of genetically modifed HSC into the tail of the mice. I have used lamps but its not helping me out and because of this I am feeling very underestimated while doing the expperiment. Can anyone suggest me some good tips regarding the intravenous tail vein injection. That will be very much grateful.

    Reply
    Posted by: Shahid C.
    December 5, 2012 - 10:30 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics