Isolierung und Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen (HSZ)

Biology

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Lo Celso, C., Scadden, D. Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs). J. Vis. Exp. (2), e157, doi:10.3791/157 (2007).

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Abstract

Protocol

Insgesamt Knochenmark Vorbereitung

  1. Vier B6-Mäuse werden getötet und seziert, um tibias, Oberschenkel, Hüfte und Wirbelsäule zu erhalten.
  2. Während der Dissektion, sind die Gliedmaßen und die Knochen in PBS 2% FCS hitzeinaktiviertem gehalten (optional 2mM EDA - Dissektion medium).
  3. Die saubere Knochen sind mit Mörser und Stößel in Dissektion Medium zerkleinert. Ein effizienter Weg, es zu tun ist, um tibias, Oberschenkel und Hüften jeder Maus, dann 2 Stacheln zu einem Zeitpunkt, zu vernichten.
  4. Die Zelle Mischung aus jeder Maus gewonnen werden getrennt und durch einen 40 um Filter in einen 50 ml Falcon-Röhrchen. Auf diese Weise enthält jedes Rohr die Zelle Mischung aus all den Beinknochen einer Maus, und die Hälfte der Mischung von 2 Stacheln gewonnen wird. In diesem Stadium wird der Filter verwendet werden, um Knochendebris trennen.
  5. Es ist normalerweise ratsam, die Beinknochen crush zweimal auf weiß zu erhalten (ohne Knochenmark) Knochenfragmente und der Wirbelsäule Fragmente 2 oder 3 mal.
  6. Füllen Sie die Rohre haben sie ausgewogen und Spin 5 min 1200rpm.
  7. Den Überstand aspirieren und lösen Sie das Pellet durch Ziehen der Rohre auf der Tube-Rack (dieser Schritt wird nach jeder Zentrifugation zur Klumpenbildung und Zellverlust zu minimieren wichtig). Resuspendieren jedes Röhrchen in 1 ml PBS 2% FCS (NO EDTA von nun an), wenn Sie tun Linie Erschöpfung sind, oder in was auch immer Band ist nichts anderes bequemer für Sie.

Lineage Depletion

  1. Dieses Verfahren ermöglicht es Ihnen, hoch differenzierte Zellen zu eliminieren und erhalten eine sehr heterogene Population von Zellen, angereichert für Stamm-und Vorläuferzellen. Wenn Sie Sortierung HSC sind, diesen Schritt reduziert drastisch die Zahl der Zellen, die durch die Zellsortierung gehen, daher reduziert Sortierung Zeit und ermöglicht Ihnen, HSC Art aus einer höheren Anzahl von Mäusen, so dass Sie eine höhere Anzahl von zu erhalten HSC in einer einzigen Sortierung.
  2. Wenn Sie vorhaben, später zu sortieren sind, nehmen Sie 50 ul Zell-Mischung (die ich gewöhnlich nehme ein bisschen von jedem Röhrchen) für die Sortierung von Kontrollen (ungefärbt und SCA1, c-Kit, CD48, Flk2 einfarbig Kontrollen).
  3. Add Lin Cocktail 30ml/tube. Lineage-Cocktail enthält eine Vielzahl von Antikörpern, die leider ein wenig Veränderungen von Labor zu Labor. In der Scadden Labor verwenden wir biotinylierten Antikörper gegen Gr1, TER119, CD4, CD8, CD3, B220. Ihre Endverdünnung in der Färbung ist 1:700.
  4. Vortex schnell zu mischen, und Inkubation für 15 min bei 4 ° C.
  5. Während der Inkubation, bereiten Sie die Spalten auf der Magneten und 15ml Elutionsgefässe in den Spalten. Degas einige PBS mit einem Steriflip Filter (Sie sollten wenig Luftblasen dem Weg zur Oberfläche des PBS durch Vakuumaspiration zu sehen), und Äquilibrierung der Säulen durch die Anwendung 3ml entgast PBS zu jeder Spalte.
  6. Die Säule fließen etwa 1ml/5min, so dauert es ca. 15 min, um die Spalten einsatzbereit zu haben.
  7. Am Ende der Inkubationszeit, fügen PBS 2% FCS zu den Rohren zu füllen und Spin-Down für 5 min bei 1200rpm.
  8. Den Überstand aspirieren, lösen Sie die Pellets und resuspendieren in 1 ml / Rohr entgast PBS.
  9. Wenn Sie später sortieren sind, nehmen Sie insgesamt Knochenmark Lineage einfarbigen Färbung ctrl (15ml, ein bisschen von jedem Röhrchen).
  10. Add Streptavidinbeads 30ml/tube, Wirbel schnell zu mischen, und Inkubation für 15 min bei 4 ° C.
  11. Am Ende der Inkubation mit 2 ml / Tube entgastem PBS. Setzen Sie neue Kollektion Röhren unter den Säulen, und gelten für jede Hinausstellung auf eine Spalte, Filtrieren durch ein 40 um-Filter.
  12. Fügen Sie weitere 3 ml entgastem PBS in jedes Röhrchen, um es zu waschen. Nachdem die Spalten leer sind, gelten wieder mit den gleichen 40 um Filter.
  13. Das Eluat enthält die Linie erschöpft Zellgemisch, eine heterogene Bevölkerung für Stamm-und Vorläuferzellen angereichert. Pool den Inhalt der 4 Röhren in 2 Röhren. Spin für 5 min bei 1500rpm.
  14. Saugen Sie den Überstand. Das Pellet sollte weiß oder vorwiegend weiß. Lösen Sie die Pellets und resuspendieren sie zusammen in 1 ml PBS insgesamt 2% FCS, wenn Sie später sortieren, sonst in welcher Lautstärke ist für Sie bequem zu resuspendieren.

LKS-oder langfristig HSC Sortierung

  1. Nehmen Sie Linie erschöpft einfarbigen Färbung ctrl (15ml). Dies ermöglicht es Ihnen, die Effizienz Ihrer Linie Erschöpfung zu beurteilen.
  2. Die Zelle Mischung zu sortieren ist in der 15ml Tube gefärbt.

Add-Antikörper:

Sca PE-Cy5.5 1: 100 10ml
Kit APC 1:100 10ml
SA PE-Cy7 1:500 2ml

So sortieren Sie langfristig HSC, auch hinzufügen:

CD48 FITC 1:1000 1ml
Flk2 PE 1:200 5ml

Auch bereiten einzelne Färbung Steuerelemente mithilfe des gesamten Knochenmarks beiseite nach der Präparation und die gesamte Knochenmark Linie gefärbt gehalten. Diese Färbungen lassen sich direkt in FACS-Röhrchen durchgeführt werden.

Achten Sie darauf, in der Dunkelheit!

  1. Vortex schnell zu mischen und bei 4 ° C für 20 bis 30 Minuten, re-Mischen auf halbem Weg durch inkubieren.
  2. Abzuwaschen der Überschuss an Antikörpern, füllen Sie das Röhrchen mit PBS 2% FCS und Spin für 5 min bei 1500 Umdrehungen pro Minute.
  3. Überstand entfernen, resuspendieren alle Pellets und verschieben Sie sie auf neue FACS-Röhrchen mit Filter Caps. Es kann eine Weile dauern, um die Zellen zu bekommen, um durch diese Filter zu gehen, und es ist wichtig, um etwas mehr PBS danach gelten, um den Filter zu waschen und zu minimieren Zellverlust. Dieser Schritt ist notwendig, um zu vermeiden das Verstopfen der Sortierer, was der schlimmste Alptraum eines jeden Zellsortierer Benutzer.
  4. Bei der Übergabe aus den Zellen in die Zelle Sortieranlage, stellen Sie sicher, bereiten auch ein Rohr mit PBS 10% FCS HALLO, wo die Zellen gesammelt werden.
  5. Wenn Sie Sortierung LKS-Zellen sind, erhalten Sie eine heterogene Population, die langfristig und kurzfristig repopulating HSC und multipotente Vorläuferzellen. Eine durchschnittliche Ertrag liegt bei 300.000 LKS von 4 Mäusen.
  6. Wenn Sie auch CD48 und Flk2 Antikörper verwendet haben, können Sie separate jeder Population von Langzeit-HSC, kurzfristig HSC und MPP. LT-HSC sind die seltenen Bevölkerung. Eine durchschnittliche Ausbeute beträgt ca. 50.000 bis 60.000 Zellen aus 4 Mäusen.

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Comments

9 Comments

  1. Hi, Thankyou for the wondeful post. I was working with endothelial progenitor cells and wanted to know how many of the bone marrow cells are Sca-1 positive. Also is it possible that we can extract the BMC and then store them at -²0 and stain them for FACS the next day? Any help will be greatly appreciated. Thanks 

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 31, 2008 - 1:45 PM
  2. You can sort on the following day, but you should keep the cells at 4C, better in an ice bucket in the fridge. Many cells die upon freezing

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 17, 2009 - 10:25 AM
  3. Can you please tell me where you purchased your streptavidin beads? Thank you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 2, 2008 - 12:33 PM
  4. miltenyi

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 17, 2009 - 10:27 AM
  5. How do you isolate muscle tissue from spin bone? And if without specific step to isolate muscle tissue, would the results of FACS be different? BTW. How do you deleption RBC form those bone marrows? Thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 23, 2008 - 4:20 AM
  6. you need to use a scalpel and much patience. LEaving muchmuscle around the spine makes it harder to crush and will reduce your yield.   RBC are depleted while lineage depleting. The post-column pellet is white. I do no recommend a separate RBC lysis because there is the risk it will damage other cells also.Moreover, it is hard to perform it consistently.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 17, 2009 - 10:29 AM
  7. How many HSCs do you inject into the irradiated recipients?

    Reply
    Posted by: Wilma J.
    August 20, 2010 - 11:39 AM
  8. Hi,
    My name is shahid chaudhary and I am working on EAE mice. The only problem i am facing with the experiment is the intravenous injection of genetically modifed HSC into the tail of the mice. I have used lamps but its not helping me out and because of this I am feeling very underestimated while doing the expperiment. Can anyone suggest me some good tips regarding the intravenous tail vein injection. That will be very much grateful.

    Reply
    Posted by: Shahid C.
    December 5, 2012 - 10:30 AM
  9. Hi,
    My name is shahid chaudhary and I am working on EAE mice. The only problem i am facing with the experiment is the intravenous injection of genetically modifed HSC into the tail of the mice. I have used lamps but its not helping me out and because of this I am feeling very underestimated while doing the expperiment. Can anyone suggest me some good tips regarding the intravenous tail vein injection. That will be very much grateful.

    Reply
    Posted by: Shahid C.
    December 5, 2012 - 10:30 AM

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