Author Produced

الحبل الشوكي الكهربية

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

مظاهرة للعزلة من الحبل الشوكي لفأر الولدان الدراسات الكهربية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal Cord Electrophysiology. J. Vis. Exp. (35), e1660, doi:10.3791/1660 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الحبل الشوكي الماوس الولدان هو نموذج لدراسة وضع circuitries العصبي الحركي والحركة. نحن لشرح تشريح النخاع الشوكي وإعداد حمام تسجيل الاصطناعية المستخدمة في السائل النخاعي الدراسات الحركي. تشريح مرة واحدة ، يمكن أن يعلق الحبل الشوكي جذور الاعصاب الاماميه الى القطب التسجيل لتسجيل الإشارات الكهربية من الدوائر نمط توليد مركزية داخل الحبل القطني.

Protocol

1. إعداد الاصطناعي السائل النخاعي (aCSF) 1. نحن نستعد لأول مرة 2L بمخزون 10X من دون aCSF المغنيسيوم أو الكالسيوم. الكواشف المدرجة في millimolar. الأرقام تشير إلى كتالوج سيغما / الدريتش.

2 ليتر aCSF 10X (بدون المغنيسيوم أو الكالسيوم)
الكاشف ملي g/2L فهرس
بوكل 40 5.96 P - 9333
كلوريد الصوديوم 1280 149.61 S - 7653
NaHCO 3 210 35.28 S - 6297
ناه 2 ص 4 5 1.38 S - 9638
جلوكوز 300 108.12 D - 9434
إضافة الماء المقطر ل2L

سوف نقوم أيضا بإعداد حلول 1M من MgSO 4 و CaCl 2 في 50mL المياه للسماح بإجراء تعديلات في molarity من التجربة والتجربة لضمان الكالسيوم يبقى في الحل.

1M الكالسيوم والمغنيسيوم مخزون
الكاشف M g/50mL فهرس
CaCl 2 1 7.35 C - 5080
MgSO 4 1 12.33 M - 5921

يجب أن يكون الحل aCSF بالغاز مع كربوجين (95 ٪ / O2 CO2 5 ٪) لخفض درجة الحموضة قبل إضافة الكالسيوم أو الكالسيوم سوف يعجل.

1 ليتر aCSF
الكاشف حجم
10X aCSF 100ML
1M CaCl 2 1 مل (تشريح) 2mL (تسجيل)
1M MgSO 4 1 مل
إضافة ~ 800 مل من الماء المقطر ، والغاز مع كربوجين لمدة 2 دقيقة قبل ان يضيف الكالسيوم
إضافة الماء المقطر ل1L.

يجب شطف مضخات وأنابيب وأطباق تشريح قبل وبعد الاستخدام.

تشريح

بينما تشريح ، ينبغي 1MM الكالسيوم aCSF بالغاز باستمرار مع كربوجين. ويمكن تحويله إلى aCSF من زجاجة إلى طبق تشريح وضخها من الطبق تشريح لزجاجة أو إرسالها إلى النفايات. نستخدم الاستومر (Sylgard ، داو كورننغ) طبق المغلفة لإجراء تشريح.

غير مقطوعة الرأس بسرعة الماوس الوليد مع مقص حاد ، والمصنوعة من شق طريق المقص الصدر والبطن البطني. ومن ثم ينتزع منه الحيوان. يتم شطف الماوس مع aCSF ينتزع منه. ثم يعلق هو الحيوان إلى الطبق مع دبابيس تشريح الحشرات من خلال إدراج الأمامية وعند قاعدة الذيل.

تتم إزالة العمود الفقري عن طريق إجراء الثقب البطني. يقام في العمود الفقري مع ملقط صغير ويتم إدراج شفرة واحدة من مقص صغير الظهرية فورا إلى العمود الفقري العظمي. هو قطع الصفيحة على جانب واحد ثم الآخر بلطف بينما رفع العمود الفقري عظمي. ويتم هذا خارج عن طول العمود الفقري.

تتم إزالة الحبل الشوكي عن طريق قطع على طول جانبي العمود الفقري لقطع جذور العصب الشوكي والسحايا المحيطة قطع الحبل الشوكي. قطعنا على الجانبين الأيسر والأيمن ، ثم قص علينا السحايا تعلق على الجانب الظهري في النخاع الشوكي لاطلاق سراحه. ويعلق ثم سلك معزول إلى الطبق بالقرب من مدخل aCSF جيدة لإعطاء الأوكسجين إذا تشريح الحيوانات إضافية.

ثم يتم نقل النخاع الشوكي لعزل طبق تسجيل باستخدام ملعقة صغيرة أو الملعقة. نحن هنا يروي إعداد مع الاوكسيجين aCSF 2mm والكالسيوم. وعلقت الحبل الشوكي إلى الطبق الاستومر micromanipulators المغلفة وتستخدم لنقل خارج الخلية ، شفط الجذر كله أقطاب بالقرب من الجذور. عند طرف القطب هو قرب نهاية الجذر الحر ، يتم تطبيق الشفط اللطيف لرسم الجذرية في القطب الشفط. ويمكن تكرار هذه العملية لتسجيل جذور عدة في وقت واحد.

الشكل 1
الشكل 1. قطع الرأس ونزع الأحشاء ألف. بسرعة بقطع رأس الفأر مع مقص حاد. ويمكن تحقيق مساهمات أكبر أو أقل من جذع الدماغ اعتمادا على خفض مستوى. باء مكان واحد شفرة المقص في افتتاح التجويف الصدري إنشاؤها بواسطة قطع الرأس. فتح الصدر والبطن بطني الى قاعدة الذيل. إزالة الأحشاء وشطف مع aCSF.

الشكل 2 الشكل 2. إزالة ألف عمود. الشوكي إدراج شفرة المقص الأيسر للفي المسافة بين العمود الفقري والنخاع الشوكي للحق وقطع الحبل الشوكي من خلال زرع عظام البطني للنخاع. ثم أدخل شفرة المقص الأيمن من في المسافة بين العمود الفقري والنخاع الشوكي الى اليسار من الحبل الشوكي وقطع. باء كرر هذه العملية مع تطبيق الجر لطيف إلى العمود الفقري. الحرص على عدم ثقب في النخاع الشوكي من خلال عقد مقص بزاوية منخفضة.

الشكل 3
الشكل 3. إزالة الحبل الشوكي ألف. إدراج شفرة المقص الأيسر للفي الفضاء بين النخاع الشوكي والعظام إلى اليمين من الحبل الشوكي والجذور من خلال قطع الحبل الشوكي والسحايا زرع الوحشي للنخاع. ثم أدخل شفرة المقص الأيمن من في الفضاء بين النخاع الشوكي والعظام وإلى اليسار من الحبل الشوكي والجذور من خلال قطع الحبل الشوكي والسحايا زرع الوحشي للنخاع. باء وأخيرا ، ورفع الحبل بلطف منقاري وقطع الحبل السري الذي يربط بين السحايا الظهرية للصفيحة. مرة أخرى اتخاذ الحرص على عدم ثقب في النخاع الشوكي من خلال عقد مقص بزاوية منخفضة. لا تقطع جذور قريبة جدا من النخاع الشوكي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

المعزولة الحبل الشوكي الولدان يوفر طريقة الانقياد لدراسة الجهاز العصبي development1 النظام ، 2. داخل النخاع الشوكي القطني من القوارض حديثي الولادة ، يمكن أن الدوائر المركزية لتوليد نمط إنتاج تنقل الوهمية في وجود العصبية. هذا تحرك الوهمية يتكون من الزيادات في النشاط الإيقاعي ، رشقات نارية ، التي يتم إنتاجها في 0،2-0،5 هرتز. ويتم تنظيم هذه رشقات نارية لإنتاج التناوب بين اليمين واليسار على طول الحبل التناوب والمثنية الباسطة - (L2 المماثل بالنسبة إلى L5). وقد أظهرت العديد من الطفرات الجينية في الفئران أن السلوك الشاذ 3-5. وسوف تفهم كيف يتم تبديل الدوائر العصبية من الحبل الشوكي أثناء تطوير والاضطرابات الوراثية تبلغ دراسات الدوائر العصبية في أماكن أخرى من الجهاز العصبي المركزي.

ومن الجدير بالذكر أن هناك العديد من الحلول القياسية aCSF في الاستخدام المنتظم. أقل من جدول الأعمال التحضيرية aCSF مستخدمة بشكل شائع.

الجدول رقم 1 : التراكيب المشتركة aCSF

مختبر aCSF التأليف في ملي
فاف ، أودونوفان ، Landmesser (3) 128 كلوريد الصوديوم ، 4 بوكل ، 1.5 CaCl 2 ، 1 MgSO 4 ، 0.5 ناه 2 ص 4 ، 21 NaHCO 3 ، 30 الجلوكوز.
غولدينغ ، Keihn (5) 111 كلوريد الصوديوم ، بوكل 3.08 ، 2.52 CaCl 2 ، 1.25 MgSO 4 ، 1.18 KH 2 PO 4 ، 25 NaHCO 3 ، 11 السكر
الحجر البني (6) 127 كلوريد الصوديوم ، 1،9-3،9 بوكل ، 1.2 KH 2 PO 4 ، 2.4 CaCl 2 ، 1.3 MgCl 2 و 26 NaHCO 3 ، 10 السكر
Ziskind - Conhaim تشريح (7) كلوريد الصوديوم 113 ، 3 بوكل ، 1 CaCl 2 ، 6 MgCl 2 و 25 NaHCO 3 ، 1 ص ناه 2 4 ، 11 السكر
Ziskind - Conhaim خارج الخلية (7) كلوريد الصوديوم 113 ، 3 بوكل ، 2 CaCl 2 ، 1 MgCl 2 و 25 NaHCO 3 ، 1 ص ناه 2 4 ، 11 الجلوكوز.
أودونوفان ، الفرخ (8،9) 139 كلوريد الصوديوم ، 2،9-5 بوكل ، 17 NaHCO 3 ، 1 MgCl 2 ، 3 CaCl 2 ، 12 السكر

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

رعاية الحيوان

Acknowledgements

صامويل فاف وهو أستاذ في مختبرات التعبير الجيني في معهد سالك للدراسات البيولوجية ومحقق في معهد هوارد هيوز الطبي. وأيد هذا العمل من قبل كريستوفر ودانا ريف مؤسسة. قدم جو Belcovson ، Schnoeker كينت ومايك سوليفان في الموارد الوسائط المتعددة في معهد سولك المساعدة في التصوير والتحرير.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KCl P-9333
NaCl S-7653
NaHCO3 S-6297
NaH2PO4 S-9638
Glucose D-9434
CaCl2 C-5080
MgSO4 M-5921
Large Scissors Fine Science Tools 14070-12
Forceps Fine Science Tools 11050-10
Fine Scissors Fine Science Tools 15000-10
Insect pins Fine Science Tools 26002-10
Sylgard 184 (Dow-Corning)
1L volumetric flask
100mL volumetric flask

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Myers, C. P. Cholinergic input is required during embryonic development to mediate proper assembly of spinal locomotor circuits. Neuron. 46, 37-49 (2005).
  2. Goulding, M., Pfaff, S. L. Development of circuits that generate simple rhythmic behaviors in vertebrates. Curr Opin Neurobiol. 15, (1), 14-20 (2005).
  3. Gallarda, B. Segregation of axial motor and sensory pathways via heterotypic trans-axonal signaling. Science. 320, (2008).
  4. Gosgnach, S. V1 spinal neurons regulate the speed of vertebrate locomotor outputs. Nature. 440, (7081), 215-219 (2006).
  5. Lanuza, G. M., Gosgnach, S., Pierani, A., Jessell, T. M., Goulding, M. Genetic identification of spinal interneurons that coordinate left-right locomotor activity necessary for walking movements. Neuron. 42, (3), 375-386 (2004).
  6. Jiang, Z., Carlin, K. P., Brownstone, R. M. An in vitro functionally mature mouse spinal cord preparation for the study of spinal motor networks. Brain Res. 816, (2), 493-499 (1999).
  7. Ziskind-Conhaim, L., Gao, B. X., Hinckley, C. Ethanol dual modulatory actions on spontaneous postsynaptic currents in spinal motoneurons. J Neurophysiol. 89, (2), 806-813 (2003).
  8. Tabak, J., Rinzel, J., O'Donovan, M. J. The role of activity-dependent network depression in the expression and self-regulation of spontaneous activity in the developing spinal cord. J Neurosci. 21, (22), 8966-8978 (2001).
  9. Chub, N., Mentis, G. Z., O'Donovan, M. J. Chloride-sensitive MEQ fluorescence in chick embryo motoneurons following manipulations of chloride and during spontaneous network activity. J Neurophysiol. 95, (1), 323-330 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics