塑料嵌入和非洲爪蟾胚胎切片

Biology

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Summary

塑料型材保持在薄薄的组织,可以用荧光抗体免疫染色的部分真正的组织形态,这种方法比较有用的,比许多类型的组织石蜡包埋或冰冻切片。染色,塑料包埋,切片的方法是在这个视频演示。

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Ogata, S., Kawauchi, S., Calof, A., Cho, K. W. Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos. J. Vis. Exp. (3), e188, doi:10.3791/188 (2007).

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Abstract

Protocol

固定

  1. 在一个小玻璃闪烁瓶转移整个胚胎或解剖植(费舍尔猫#03 - 339 - 25B)到MEMFA或3.7%FA + PBS。在室温孵育nutator小瓶, 只有 2个小时,而不是不止于此。不要离开2个多小时的胚胎在FA。在FA的潜伏期较长,会使胚胎组织的困难,并导致在检测过程中的抗体差渗透。

  2. 吸大部分的FA和添加登特的固定液的小瓶(〜4.5毫升)顶部。轻轻颠倒几次小瓶洗登特的胚胎,用另一种新鲜的凹痕4.5毫升交流,并在-20 ° C 孵育至少48小时。隔夜不足够的。这一步使胚胎抗体的渗透性。胚胎可以保持在这几个星期的情况下。

免疫

  1. 补充水分的标本。在甲醇梯度培养,如下:

    75%甲醇/ H 2 O 10分钟
    50%甲醇/ PBS 10分钟
    25%甲醇/ PBS 10分钟
    PBS 10分钟
    PBS 10分钟

  2. 60毫米塑料菜1.5%琼脂糖/ PBS板。倒入琼脂糖上PBS后,它已成为固体。

  3. 半胚胎切片 :将在1.5%琼脂糖/ PBS板的胚胎。一双镊子抓住一个胚胎,并削减了一半的胚胎,用薄薄的刀片中心。选择,您已成功地削减了一半,直切平面的。

    图1

  4. 平分胚胎转移到与PBT的玻璃闪烁瓶。交流4.5毫升的20%山羊血清+ PBT。在室温下孵育2小时上nutator(阻塞)。

  5. 准备适当稀释,在PBT的主要抗体。这每样本0.5毫升是必要的。例如,我用1 / 200稀释的兔抗c - cadherin的多克隆研究在5mm的塑料型材的C - cadherin的亚细胞定位。

  6. 吸出阻塞的解决方案,并添加稀释的抗体0.5毫升。在泡沫塑料管持有人站立位置的小瓶。在nutator 4 º C孵育过夜。

  7. 将稀释的抗体(这种稀释的抗体可以保存并在未来1-2周重复使用)。与PBT的4.5毫升洗4次(每次40-60分钟)在室温下。

  8. 交换的1 / 100稀释生物素标记的第二抗体在PBT0.5毫升。在nutator 4 º C孵育过夜。用铝箔盖住,以防止光素的小瓶。

  9. 从这一点来说, 应采取保护光,即样品,保留下一些盖或铝箔的小瓶。

  10. 删除中学生物素的抗体(这也可以在未来的1-2周重复使用)。洗或PBT4.5毫升4倍(40-60分钟)在室温。

  11. 交换的1 / 200稀释的荧光标记(FITC,德克萨斯红等),在PBT链霉0.5毫升。在nutator 4 º C孵育过夜。

  12. 卸下的链霉(可重复使用,这太)。与PBT的4.5毫升洗3次(15 - 30分钟)在室温下。

  13. 30分钟,在室温下固定在3.7%FA + PBS4.5毫升胚胎。

  14. 与PBS4.5毫升洗两次。

  15. 脱水标本。孵育在乙醇分级系列,如下:

    30%的乙醇/ H 2 O 10分钟
    50%乙醇/ H 2 O 10分钟
    75%乙醇/ H 2 O 10分钟
    100%乙醇 10分钟


  16. 试样可存储100%乙醇在4 º C具有保护盖由轻。

浸润

  1. Technovit 7100渗透混合。我通常在50ml的锥形管的基液15毫升,添加固化剂150毫克的我​​,并为15分钟nutator摇摆混合。这种渗透组合,可以保持在4 ° C至一个月。

  2. 渗透与渗透混合标本,通过交流与Technovit渗透的混合/乙醇组合分级系列,如下:

    1. Technovit /乙醇 - 1小时50%

    2. 100%Technovit - 1小时

    3. 100%Technovit - 隔夜

  3. 该specimen可以在100%的渗透混合存储长达一个月在4 ° C。样品放在封面,以保护他们的光。

嵌入

  1. Technovit 7100嵌入组合:以0.75毫升渗透在1.5毫升管组合,并添加固化剂二50毫升。颠倒几次管混合。

  2. 用塑料移液管,取一个试样渗透到0.5ml薄壁PCR管中过夜。删除的大部分上清。

  3. 添加在本节步骤#1,“嵌入”,在试样上的嵌入组合0.25毫升。东方平分胚胎面临的试管底部夹层平面,轻轻地用钝尖清扫针(木处理清扫针)轻推。

  4. 关闭盖子,并在黑暗的地方约四小时,孵化管允许的塑料聚合。

  5. 请Technovit 3040组合。称量皿中以1克的粉末,而添加的液体0.5毫升。随即,混合粉末和液体使用bluetip。倒入硬化spacimen顶部。这黄色的Technovit 3040,防止来自管整个塑料块。

切片

  1. 请用二甲苯Histoknife H(乙醇往往是不够好),并设置您的切片。角度约45 °的刀片。用二甲苯擦拭刀片前面舞台区,也因为这方面的清洁切片切片质量的关键。

  2. 切管方和剥离,关闭使用的纸板刀的尖端。

    图2

  3. 设置成夹头持有人的切片标本​​。

  4. 一个载玻片上附加一个“按密封”绝缘体上硅,使安装节片室。用力按下绝缘体清洁台式幻灯片,从另一个侧面看,以确保该绝缘子是完全没有任何气泡附着。倒干净,温馨的DH 2 O(〜40℃)使用巴斯德吸管的幻灯片池,这里可以看出,水面变得平缓,没有凹或凸的形状的水平。

  5. 开始节片。对于免疫的研究,我5毫米的节片。 原位杂交样品 ,可以调整切片的厚度在〜3 - 8毫米的范围内,根据目的和信号强度。

  6. 卡里的节片从刀片前面阶段的安装与水室,用一个小的画笔。一片水池上方握住画笔和降片敲钝尖清扫针水。片将扩大成圆形,尽快到达水面。

  7. 当安装室内的水面面积大部分是充满节片,几乎一半的水使用巴斯德吸管吸。孵育幻灯片温暖过夜,以使样品完全干燥的幻灯片。

  8. 反染色的DAPI(在TE为0.1mg/ml)1毫升五分钟。吸DAPI染色和干燥的样品。

  9. 从幻灯片中删除的硅橡胶绝缘子。现在可以采取的样品图片。样品存放在4℃,避光。

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PBS Buffer 1L recipe8.0gNaCl0.2gKCl2.68gNa2HPO4·7H2O0.2gKH2PO4The pH is supposed to be 7.4. Adjust the volume to 1L. Autoclave.
PBT Buffer Add 0.5ml of Triton X-100 and 1.0g of BSA (Molecular Biology grade, fraction V is good [>99%], but don’t use crude 97% Albumin) to 500ml of autoclaved PBS. Filtrate through 0.2mm filter cup. Store it in 4ºC.
·Dent’s fixative Reagent Mix 40ml of methanol and 10ml of DMSO. Keep it in –20°C.
3.7% FA+PBS Reagent Mix 37% formaldehyde and PBS at 1:9 ratios. Make it fresh at each time and discard the left over.
Biotinylated Anti-Mouse IgG (H+L), made in goat Ab Vector Laboratories BA-9200
Biotinylated Anti-Rabbit IgG (H+L), made in goat Ab Vector Laboratories BA-1000
IG’S HUADS BIOTIN GTXRBT Ab Invitrogen ALI3409 BioSource™
IgG (g), Goat Anti-Mouse Ab Invitrogen M30115 CALTAG™
Fluorescent streptavidin kit Reagent Vector Laboratories SA-1200 Contains streptavidin labeled with three different fluorophores (FITC, Texas Red and AMCA) suitable for this procedure.
20% goat serum/PBT Buffer This will be used as a blocking solution.
Small paintbrush Tool
Dull-tip dissection needle Tool
Kulzer Technovit 7100 GMA , 3040 Reagent 7100 GMA , 3040 glycol methacrylate
Kulzer Tungsten Histoknife H Tool Energy Beam Sciences H1310
75% MeOH/H2O Buffer
50% MeOH/PBS Buffer
25% MeOH/PBS Buffer
30% EtOH/H2O Buffer
50% EtOH/H2O Buffer
75% EtOH/H2O Buffer
100% EtOH Buffer
Small glass scintillation vials Tool Fisher Scientific 03-339-25B
0.5ml Thin-wall PCR tubes Tool Molecular BioProducts 3430
Press-to-Seal Silicone Rubber Insulators Tool Grace Bio-Lab Inc. JTR1L-2.5 32mm L x 19mm W, 2.5mm D
Thin razor blade Tool
1.5% Agarose in PBS
Primary antibody against your antigen or epitope tags: Make an appropriate dilution in PBT.Biotin-conjugated secondary antibody: various vendors sell biotin-conjugated antibodies.

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Comments

1 Comment

  1. So what are the advantages of plastic sectioning over frozen/wax embedding + sectioning?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 17, 2008 - 11:13 AM

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