एक प्रतिकृति सिर पर एक शाही सेना पोलीमरेज़ द्वारा रुकाहुआ कांटा के प्रत्यक्ष पुनरारंभ करें

Biology
 

Summary

replisome के भाग्य के साथ एक टक्कर के बाद एक सिर पर शाही सेना पोलीमरेज़ (RNAP) अज्ञात है. हमें लगता है कि सिर पर एक RNAP के साथ टकराव पर replisome स्टालों, लेकिन डीएनए से RNAP displacing के बाद बढ़ाव शुरू. Mfd RNAP की टक्कर के बाद विस्थापन की सुविधा के द्वारा प्रतिकृति पुनरारंभ को बढ़ावा देता है.

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Pomerantz, R. T., O'Donnell, M. Direct Restart of a Replication Fork Stalled by a Head-On RNA Polymerase. J. Vis. Exp. (38), e1919, doi:10.3791/1919 (2010).

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Abstract

Vivo में अध्ययन का सुझाव है कि प्रतिकृति कांटे के साथ सिर पर प्रतिलेखन परिसरों कारण मुठभेड़ों को गिरफ्तार कर रहे हैं. फिर भी, replisome और आरएनए पोलीमरेज़ (RNAP) के भाग्य निम्नलिखित टक्कर सिर पर अज्ञात है. यहाँ, हम पाते हैं कि ई. replisome स्टालों कोलाई के साथ टकराव पर एक सिर पर प्रतिलेखन जटिल, लेकिन बजाय टूट के, प्रतिकृति कांटा अत्यधिक स्थिर रहता है और अंततः डीएनए से RNAP displacing के बाद बढ़ाव शुरू. हम यह भी पाते हैं कि प्रतिलेखन मरम्मत युग्मन कारक, MFD, RNAP के विस्थापन की सुविधा से टक्कर के बाद कांटा के प्रत्यक्ष पुनरारंभ को बढ़ावा देता है. इन निष्कर्षों प्रतिकृति तंत्र के आंतरिक स्थिरता और प्रतिलेखन युग्मित RNAP ब्लॉक पिछले प्रतिकृति को बढ़ावा देने में मरम्मत मार्ग के लिए एक उपन्यास भूमिका प्रदर्शित करता है.

Protocol

इस विधि में रिपोर्ट अनुसंधान में इस्तेमाल किया गया था Pomerantz और O'Donnell, विज्ञान 327, 590-592 (2010) .

1. एक रुका RNAP बढ़ाव परिसर के सभा के रूप में प्रदर्शन किया गया था:

की 500 एनएम अंतिम एकाग्रता कोलाई RNAP 70 σ महामहिम एनएम 5 biotinylated 3.6 केबी डीएनए बफर के (20 मिमी (7.5 पीएच) Tris-सीएल, 8 मिमी 2 MgCl, 0.5 मिमी EDTA, 5 100 μl में T7A1 प्रमोटर युक्त टेम्पलेट के अंतिम एकाग्रता के साथ मिलाया गया था मिमी डीटीटी, 10% ग्लिसरॉल) 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस APU और GTP, एटीपी, और CTP के 40 सुक्ष्ममापी प्रत्येक के 100 सुक्ष्ममापी 37 पर एक अतिरिक्त 10 मिनट डिग्री सेल्सियस के लिए जोड़े गए

2. रुका RNAP बढ़ाव जटिल streptavidin मोती पर स्थिरीकरण के रूप में प्रदर्शन किया गया था:

Streptavidin चुंबकीय लेपित मोती (Invitrogen) के 200 μl ऊपर कमरे Temp में 10 मिनट के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए जोड़ा गया था.

3. Immobilized रुका RNAP बढ़ाव परिसर के शोधन के रूप में प्रदर्शन किया गया था:

मोती (से ऊपर) बफर के 0.9 मिलीग्राम एक युक्त 0.75 एम NaCl, 200 μg / मिलीलीटर हेपरिन, और 20 μg / मिलीलीटर (सतह पर तैरनेवाला चुंबकीय जुदाई के द्वारा प्रत्येक धोने कदम के बाद हटा दिया गया था.) अगला ssDNA, के साथ 5 बार धोया गया मोती बफर ए के 0.9 मिलीग्राम के साथ 2 बार धोया गया

4. : एक प्रतिकृति बहाव के सिर पर RNAP के रूप में प्रदर्शन किया गया था करने के लिए सापेक्ष कांटा का गठन

मोती (से ऊपर) न्यू इंग्लैंड Biolabs 4 बफर और एसएपी मैं (न्यू इंग्लैंड Biolabs) की 10 इकाइयों के 100 μl में resuspended गया 10 मिनट के लिए 37 में जोड़ा गया डिग्री सेल्सियस मोती एक बफर के 0.9 मिलीलीटर के साथ 3 बार धोया गया और तब त्वरित टी -4 Ligation प्रतिक्रिया बफर (न्यू इंग्लैंड Biolabs) के 50 μl में resuspended. त्वरित टी -4 ligase (न्यू इंग्लैंड Biolabs) के 2 μl साथ पूर्व annealed काँटेदार डीएनए के 6 एनएम अंतिम कमरे Temp में 10 मिनट के लिए (RP10, RP22, RP25) एकाग्रता के साथ जोड़ा गया है. मोती बफर ए के 0.9 मिलीलीटर के साथ 3 बार धोया गया

5. Replisome और प्रतिकृति दोराहे पर अग्रणी कतरा संश्लेषण की दीक्षा की सभा के रूप में प्रदर्शन किया गया था:

DnaB (hexamer के रूप में) की 448 pmol बफर के मोती μl 150 के साथ incubated किया गया था (20 मिमी Tris सीएल (7.5 पीएच), 8 मिमी 2 MgCl, 0.5 मिमी EDTA, 5 मिमी डीटीटी, 10% ग्लिसरॉल) में 30 s के लिए 23 डिग्री सेल्सियस पोल क्ष्क्ष्क्ष् के 4.9 pmol * (पोल क्ष्क्ष्क्ष् वह शून्य β), β के 15 pmol, 2 मिमी एटीपी, और 60 dGTP और dATP के प्रत्येक सुक्ष्ममापी 200 μl की एक मात्रा के लिए जोड़ा गया था और 37 पर एक और 5 मिनट डिग्री सेल्सियस incubated प्रतिकृति के साथ 10 μg एसएसबी और 24 dATP और dTTP के प्रत्येक सुक्ष्ममापी जोड़ने पर शुरू किया गया था [α-32 पी] dTTP और [α-32 पी] dCTP (विशिष्ट गतिविधि, 3,000-5,000 सीपीएम / pmol) 250 का एक अंतिम मात्रा के लिए μL. प्रतिक्रियाओं 500 मिमी EDTA के 12 μl जोड़ने पर 10 मिनट के बाद समाप्त किया गया.

6. शोधन और रेडियो लेबल डीएनए उत्पादों की एकाग्रता के रूप में प्रदर्शन किया गया था:

मोती (से ऊपर) के बाद प्रतिक्रिया क्रम में समाप्त किया गया मोतियों से डीएनए निकालने उबले थे. कोई अवशिष्ट डीएनए शेष मोती जुड़ी proteinase कश्मीर के साथ मोती 10 उल का एक मात्रा में 30 मिनट के लिए इलाज के 50 में डिग्री सेल्सियस से हटा दिया गया था मोती और फिर उबला हुआ सतह पर तैरनेवाला चुंबकीय जुदाई से हटा दिया गया था. संयुक्त सतह पर तैरनेवाला युक्त डीएनए Qiagen पीसीआर सफाई किट का उपयोग कर शुद्ध किया गया था. शुद्ध रेडियो लेबल डीएनए उत्पाद तो एक alkaline agarose जेल में विश्लेषण किया गया.

* सिर पर RNAP रुका बढ़ाव परिसर में ऊपर के रूप में प्रदर्शन किया गया था, लेकिन σ, 70 के अभाव में प्रतिकृति लोप किया गया था .

प्रतिनिधि परिणाम:

साथ replisome के टकराव एक सिर पर RNAP आमतौर पर 2.5 केबी और लंबाई में 3.6 केबी के दो उत्पादों में परिणाम है. 2.5 केबी उत्पाद कांटा से रुका RNAP और replisome से परिणाम RNAP के साथ टकराव पर रोकने के लिए डीएनए की लंबाई का प्रतिनिधित्व करता है. 3.6 केबी उत्पाद या तो प्रमोटर के RNAP द्वारा अधूरा अधिभोग या आंशिक replisome सिर पर RNAP पढ़ने के माध्यम से पूर्ण लंबाई डीएनए और परिणाम का प्रतिनिधित्व करते हैं. एक अच्छा या सटीक परिणाम यह दर्शाता है कि लगभग 50% पूर्ण लंबाई डीएनए का उत्पादन किया है. हालांकि, कुछ मामलों में RNAP द्वारा प्रमोटर के अधिभोग कम होता है और पूर्ण लंबाई डीएनए के एक उच्च प्रतिशत replisomes की एक बड़ी जनसंख्या के बाद से मनाया जाता है सिर पर एक RNAP का सामना नहीं करते. केवल पूर्ण लंबाई डीएनए (3.6 केबी) में रुका RNAP परिणाम के अभाव में प्रतिकृति.

चित्रा 1
चित्रा. 1 replisome सिर पर RNAP द्वारा अवस्र्द्ध है.
(ए) प्रायोगिक सेटअप. एक ई. कर्नलमैं RNAP रुका बढ़ाव परिसर में एक biotinylated T7A1 प्रमोटर के रूप में पहले वर्णित (9) युक्त डीएनए पर इकट्ठा किया गया था . संक्षेप में, एक रुका बढ़ाव जटिल biotinylated डीएनए के साथ 10 मिनट के लिए एक और आगे 10 मिनट के लिए APU, GTP, एटीपी, और CTP के अलावा द्वारा पीछा RNAP holoenzyme incubating द्वारा प्रमोटर से 20 बीपीएस बहाव गठन किया गया था. Streptavidin मोती एक अतिरिक्त 10 मिनट तो मोती पांच बार धोए थे 0.75m NaCl, 200 हेपरिन मिलीग्राम / एमएल और 100 एकल भूग्रस्त एनएम अस्थिर RNAP डीएनए परिसरों और अतिरिक्त NTPs हटाने के लिए डीएनए युक्त बफर के 0.9 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक के लिए जोड़े गए . डीएनए तो SAPI के साथ पचा था धोया, और एक पूर्व annealed काँटेदार डीएनए ligated. मोती फिर से धोया गया replisome की विधानसभा के लिए पहले. प्रमोटर कांटा से 2.5 केबी स्थित है और कांटा दिशा में प्रत्यक्ष प्रतिलेखन के लिए उन्मुख है. (बी) DnaB जोड़ा गया तो replisome इकट्ठा किया गया था और प्रतिकृति या तो उपस्थिति में शुरू किया गया था (2 लेन) या के अभाव (1 लेन) सिर पर RNAP.

Disclosures

वॉशिंग रुका बढ़ाव जटिल उच्च नमक के साथ मोती के लिए बाध्य महत्वपूर्ण है क्रम में किसी भी अस्थिर या गैर विशेष रूप से बाध्य RNAP अणुओं को दूर. RNAP प्राइमर टेम्पलेट प्रकार डीएनए संरचना के लिए एक अत्यंत उच्च आत्मीयता है. इस प्रकार, यह आवश्यक है जैसे गैर विशिष्ट RNAP डीएनए परिसरों को हटाने के क्रम में प्राइमर टेम्पलेट से प्रतिकृति प्रदर्शन. रेडियो लेबल डीएनए Qiagen पीसीआर शुद्धि किट उत्पादों का उपयोग कर ध्यान केंद्रित भी क्रम में एक पर्याप्त उच्च रेडियोधर्मी संकेत है कि जेल में मनाया जा सकता है है को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है.

Acknowledgements

हम विशेष रूप से RNAP और MFD प्रोटीन और अभिव्यक्ति वैक्टर प्रदान करने के लिए सेठ Darst के लिए आभारी हैं. हम भी तकनीकी सहायता के लिए GreB और दान जांग प्रदान करने के लिए सर्गेई Borukhov धन्यवाद. इस काम के स्वास्थ्य (MOD) के राष्ट्रीय संस्थानों से एक अनुदान द्वारा और Marie-Josée और रॉकफेलर विश्वविद्यालय (RTP) में हेनरी Kravis फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dynabeads M-270 Invitrogen 653.05
SapI New England Biolabs R0569S
T4 Quick Ligase New England Biolabs M2200S
PCR Purification Kit Qiagen 28104

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References

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