モデル遺伝生物として使用するためのメダカ胚のマイクロインジェクション
December 22nd, 2010
メダカとゼブラフィッシュは、脊椎動物のゲノム機能の遺伝的解剖のための補完的です。このプロトコルは、メダカ胚に成功したマイクロインジェクション、実験室でのメダカとゼブラフィッシュを用いた発生学と遺伝学的解析のための重要な手法のためのキーポイントを強調しています。
この手順の全体的な目標は、目的の遺伝子またはタンパク質の正常な発現パターンを破壊することにより、遺伝子タンパク質の機能を決定することです。これは、最初にaros型と注射針を作ることによって達成されます。手順の2番目のステップは、1つの細胞段階で中間胚を収集することです。
手順の3番目のステップは、1つの細胞期の胚を注入のための正しい位置に向けることです。手順の最終ステップは、細胞トレーサー、mRNA、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを1細胞期の中央胚に注入することです。最終的には、注入された物質の影響を受けたタンパク質に関連する形態学的、生理学的、または分子的な変化を示す顕微鏡観察によって結果を得ることができます。
こんにちは、バース大学生物学・生化学部のマコト・フキ博士の研究室のショーン・ブラジンスキーです。私もフルセキラボから来ています。本日は、細胞トレーサー、mRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたMeca胚のマイクロインジェクションの手順をご紹介します。
私たちの研究室では、この手順を使用して、生体内の目的遺伝子の機能を単一細胞レベルで研究しています。それでは始めましょう。ゼブラフィッシュとは異なり、オスとメスのマカは二形性のヒレで簡単に区別できます。
女性のひれは丸い形をしており、縁取りは滑らかです。オスの臀鰭と背びれはどちらもメスのものよりも大きく、背びれには最後の2本の光線の間に深い切り欠きがあります。嵌合ペアのメカを、水流の有無にかかわらず嵌合タンクに保管してください。
このPは、流水を入れたタンクに最大2ヶ月間保管することができます 毎日の注射の場合、メカは毎日最大40個の卵を産み、付着フィラメントによって腹に集まります。網を使って雌を捕まえて水槽から取り出し、片手で魚を捕まえて網の中に固定します。人差し指で卵をそっとからかいます。
メスをタンクに戻します。鉗子または人差し指を使用して、卵子を胚培地で満たされた6センチメートルのシャーレに移します。解剖顕微鏡下で、2対の鉗子を使用して付着フィラメントを切断し、卵のクラスターを解除します。
パスタピペットで胚を拾い上げて糞便や藻類から分離し、最大40個の卵子を新鮮な胚の皿に移します。中程度。すぐにマイクロインジェクションする場合は、卵を氷の上に置きます。あるいは、インキュベーション温度の変化に応じて、開発の速度を後の段階に操作します。
注入中に胚を保持するためのアガロースプレートを作るには、プレキシガラス型が必要です。詳細については、このプロトコルの記述された部分を参照してください。0.5センチメートルの1.5%アロスを水に注ぎます 9センチメートルのシャーレ。
アースが固まったら、型が底に沈まないように、型より少し小さい領域を切り取ります。1.5%aaseを多く使用してカット領域を作成し、その上にプレキシガラスの型を置きます。アリスが固まったときに気泡を入れないようにしてください。
通常、型を離してトラフを作成します。アリスを胚培地で覆います。皿を覆い、使用する準備ができるまで摂氏4度で保管します。
ガラスキャピラリーを含むフィラメントから強力の幅広の注入針を調製します。マイクロローダーを使用して、フェノールレッドを含む注射液で注射針を埋め戻しますトレーサーとして、針をエアポンプインジェクタースタンドに接続します。解剖顕微鏡の隣に設置します。
適切な段階の卵を生じた注入プレートに移します。胚を最大30分間氷上に保持して、実体顕微鏡下で注入を行いながら発生を停止させることができます。鉗子を使用して、各トラフに7〜10個の卵を整列させます。
注射針が卵に垂直に当たるように卵を回転させます。胚の1つの細胞は、へこんだ土壌液滴の反対側にあります。したがって、油滴は、1つのセルが注射のために右側になるように、左に向ける必要があります。
メカでは、核酸とトレーサー色素は、コーリアンを介して卵黄ではなく胚の細胞質にマイクロ注入されます。ゼブラフィッシュは、針を卵に近づけます。針の先端をコーリアンに触れるか、マイクロ鉗子を使用して針の先端を折って開き、少量の注入液が端から流出するようにします。
詰まりの場合は針を再び折らし、コーリアンに穴を開け、注射針の先端を内層のすぐ内側に動かして、針への逆流の可能性を減らします。インジェクターの保持圧力を約80〜100ヘクタールに急激に調整します。メンブレンを突き刺し、針を細胞質に挿入します。
胚を注入します。胚を横から見て、注入された物質が細胞質内に均一に分布していることを確認します。細胞質に正しく注入された液体は、卵黄に深く注入されたぼやけた境界物質を持ち、境界が明確であり、細胞質に移されません。
注入した胚を胚培地の清潔な皿に移し、必要に応じてそれらを成長させる適切な温度のインキュベーターで、パネルAは、1細胞期のメカ胚の細胞質への反芻デキストランの正しい注射の代表的な画像を示しています。パネルBは、1細胞期の卵黄嚢への反芻dex strの誤った注入の代表的な画像を示しています。Meca胚の点線は、1つの細胞の細胞質の輪郭を示しています。
パネルCおよびDは、それぞれパネルAおよびBからの胚を、注入後約30時間で示しています。パネルDの胚の体は、色素が誤って卵黄袋に注入されたため、赤くないことに注意してください。私たちは、より暗い胚の1つの細胞段階に核酸またはトレーサーをマイクロインジェクションする方法を示しました。
この手順を行うときは、注入を成功させるために胚を正しく病期分類することが重要です。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。
概要
このプロトコルは、脊椎動物モデルにおける遺伝子解析に不可欠なメダカ胚のマイクロインジェクション技術を概説しています。胚の準備と注入方法を含む、成功した注入に必要な手順を詳細に説明しています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 発生学
- 遺伝学
- 発生生物学
背景
- メダカとゼブラフィッシュは遺伝子研究のための補完的なモデルとして機能します。
- マイクロインジェクションは遺伝子発現を操作するための重要な技術です。
- 遺伝子機能の理解は発生生物学研究にとって重要です。
- 適切な胚のステージングは成功したマイクロインジェクションにとって重要です。
研究の目的
- 正常な発現パターンを阻害することで遺伝子タンパク質の機能を決定すること。
- メダカ胚におけるマイクロインジェクションプロセスを実証すること。
- 単一細胞レベルでの遺伝子機能のin vivo研究を促進すること。
使用された方法
- 胚保持のためのアガロースモールドの準備。
- 一細胞期胚の収集と注入のための正しい位置決め。
- 細胞質への核酸とトレーサーのマイクロインジェクション。
- 注入後の形態学的および生理学的変化の観察。
主な結果
- 成功した注入は胚の発達に観察可能な変化をもたらします。
- 細胞質への正しい注入は効果的な遺伝子操作にとって重要です。
- 注入の成功は顕微鏡を通じて視覚的に確認できます。
- 卵黄嚢への不正確な注入は明確な境界と遺伝子発現の変化の欠如をもたらします。
結論
- マイクロインジェクションはメダカ胚の遺伝子機能を研究するための効果的な方法です。
- 適切な技術と胚の取り扱いは成功した実験にとって不可欠です。
- このプロトコルは脊椎動物におけるさらなる遺伝子研究の基礎を提供します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Microinjection of medaka embryos enables precise genetic manipulation for target validation in vertebrate models, supporting mechanistic de-risking in early discovery. The technique provides a disease-relevant system for phenotypic screening and assay development, leveraging medaka's genetic complementarity with zebrafish to identify novel targets. This approach enhances predictive confidence in lead identification by enabling functional interrogation of genes of interest in vivo.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables therapeutic hypothesis interrogation through targeted gene knockdown or overexpression to clarify gene function.
- Operational Value: Supports biological de-risking by allowing direct observation of phenotypic consequences of gene perturbation.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by generating quantitative data on molecular and morphological changes linked to protein function.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by ensuring consistent embryo staging and injection accuracy.
- Operational Value: Promotes assay standardization through reproducible microinjection protocols and visual confirmation of cytoplasmic delivery.
- Scalability: Enables platform reuse across multiple targets via standardized needle preparation and embryo alignment procedures.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery findings to preclinical validation through conserved vertebrate pathways observable in medaka embryogenesis.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in target validation by distinguishing cytoplasmic from yolk-specific injection outcomes via microscopy.
- Disease-Relevant System: Leverages medaka's genetic divergence from zebrafish to uncover phenotypes missed in single-species studies, broadening target scope.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling gene function assessment prior to lead optimization, with outputs informing go/no-go decisions based on phenotypic severity and specificity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by allowing precise spatiotemporal disruption of gene expression in developing embryos.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized embryo preparation and injection needle calibration for consistent compound or nucleic acid delivery.
- Analytics: Provides quantitative phenotypic readouts via microscopy, enabling comparison of injected versus control embryos for target validation.
- Translational Research: Connects to preclinical work through conserved developmental pathways, supporting extrapolation of findings to mammalian models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for genetic screening campaigns via standardized agarose mold preparation and embryo handling procedures.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing false positives through direct phenotypic observation.
- Operational Value: Enhances reproducibility via standardized embryo orientation, injection pressure settings (80-100 hPa), and cytoplasmic delivery confirmation.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early-stage de-risking of targets before investment in costly lead optimization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions by generating clear morphological and molecular phenotypes linked to gene function.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryology and microsurgery for proper embryo staging and needle handling.
- Depends on instrumentation including microinjectors, dissecting microscopes, and capillary needles for precise delivery.
- Necessitates cross-team standardization of embryo medium composition, incubation temperature, and injection timing for consistent results.
- Involves adaptation considerations across fish species due to differences in chorion structure and yolk size affecting injection depth.
- Limited by embryo availability and developmental synchrony, requiring timed mating and temperature-controlled staging for large-scale studies.
