Dünnschnitt der Scheibe Vorbereitungen für die Immunhistochemie

Published 4/28/2007
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Biology

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Summary

Das vorliegende Verfahren ermöglicht reproduzierbare Kryostat Schnitte von kleinen, schwer zu verwalten, Gewebeteile, wie Biopsien und Hirnschnitten. Wir verwenden ein einfaches Aluminium Einfrieren der Bühne um die Behandlung von Gewebe-und ein Standard-Kryostat routinemäßig produzieren 5-10 Mikrometer Serienschnitte von 400 Mikrometer dicken Hirnschnitten zu erleichtern.

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Park, J., Cunningham, M. G. Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (3), e194, doi:10.3791/194 (2007).

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Abstract

Viele Untersuchungen in den Neurowissenschaften sowie anderen Disziplinen, auch mit der Analyse kleine, aber makroskopische Stücke oder Abschnitte von Gewebe, die erhalten wurden, frisch entfernt oder ausgeschnitten, aber lebensfähig gehalten, wie in Scheibe Vorbereitungen des Hirngewebes. Nachfolgende mikroskopische Untersuchungen dieses Materials kann eine Herausforderung sein, da die Gewebeproben kann schwierig zu handhaben. Hier gezeigt wird ein Verfahren zur Gewinnung dünne Kryostatschnitte des Gewebes mit einer Dicke von 0,2 bis 5,0 mm, die reichen können. Wir routinemäßig Schnitt 400 Mikron dick Vibratom Hirnschnitten seriell in 5-10 Mikrometer koronalen Kryostatschnitte. Die Scheiben sind in der Regel zunächst für Elektrophysiologie Experimente verwendet und dann verlangen, mikroskopische Analyse der Zytoarchitektur der Region, aus der die Aufnahmen wurden nicht beobachtet. Wir haben ein einfaches Gerät, das kontrollierte und reproduzierbare Herstellung und Positionierung der Gewebeschnitt erlaubt konstruiert. Dieses Gerät besteht aus einem Zylinder 5 cm in der Länge mit einem Durchmesser von 1,2 cm, die als Bühne für das Einfrieren der Scheibe dient. Ein Ring eng gleitet über den Zylinder bietet Mauern um die Scheibe so dass das Gewebe in dem Gefrierpunkt Verbindung eingetaucht werden (zB OCT). Dies ist dann schnell mit zerstoßenem Trockeneis eingefroren und die daraus resultierenden Wafer Position leicht für Kryostat Schnitte. Dünne Schnitte werden können Tau-montiert auf beschichtete Objektträger, damit weitere Untersuchungen durchgeführt, wie verschiedene Färbemethoden werden, in-situ-Hybridisierung oder Immunhistochemie, wie hier gezeigt.

Protocol

  1. Bereiten Form von Band für die OCT-Plattform.
  2. Fill Form mit Oktober Einfrieren des Kryostaten oder mit zerkleinertem Trockeneis.
  3. Entfernen Sie das Klebeband aus der ganzen gefrorenen OCT-Plattform.
  4. Richten Sie Markierungen auf dem Gefrierpunkt Spannfutter und Kryostat Montage der Bühne und Schloss im Futter.
  5. Schnitt durch OCT-Plattform bis die Oberfläche ist flach.
  6. Entfernen Sie tauchte OCT-Plattform und am Kryostaten Einfrieren der Bühne.
  7. Legen Sie Gewebeprobe (bisher mit 30% Glycerin oder Saccharose in PBS kryokonserviert) in Oktober
  8. Bereiten Sie das Einfrieren Spalte mit Außenring projizieren ca. 5 mm über der Oberseite der Säule bildet auch für Oktober
  9. Vorsichtig Position Gewebeprobe in die Mitte der Gefrierpunkt Spalte Oberfläche und langsam Okt bis gut gefüllt ist.
  10. Surround Einfrieren Spalte mit zerkleinertem Trockeneis. Tissue-und OCT sollte vollständig innerhalb 20-60 Sekunden einfrieren.
  11. Als Vorbereitung Temperaturerhöhungen, kann der Außenring entfernt, während die Probe bleibt eingefroren werden.
  12. Slide Probe aus dem Gefrierpunkt Spalte seitlich und in Kryostaten.
  13. Legen drop der OCT auf der Oberfläche des OCT-Plattform und die Position Probe (Gewebe down) Anwendung festem Druck. Specimen wird schnell auf OCT-Plattform einfrieren.
  14. Sichere Spannfutter auf Kryostat Montage der Bühne mit den Noten ausgerichtet.
  15. Schnitt durch Oktober oberflächlich auf die Gewebeprobe.
  16. Thaw montieren dünne Schnitte auf Objektträger und speichern gefroren oder bei Raumtemperatur.
  17. Immunreaktionen können für das Tissue auf Glasträger montiert durchgeführt werden.
  18. Reagenz wird auf Folie gebündelt, können leicht geschüttelt werden und kann gedeckt, wenn lichtempfindlichen werden.
  19. Spätere Phasen der Umsetzung sind einfach durch Umdrehen Abgleiten in die Abfallbehälter durchgeführt, Feuchtigkeitsregulierung der Folie, und dann die Anwendung des nächsten Reagenz.

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Discussion

Das Protokoll hier vorgestellten bietet den Forschern eine prägnante, leicht zu folgen skizzieren, wie dünn Kryostatschnitte von kleinen, schwer zu verwalten, Gewebeteile, wie Biopsien und Hirnschnitten für weitere Studien durchgeführt werden, wie erhalten verschiedenen Färbemethoden, in-situ-Hybridisierung oder Immunhistochemie.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
O. C. T. Ted Pella, Inc. 27050
Glycerol Solution 30% Glycerol Solution in PBS w/v
Sucrose Solution 30% Sucrose Solution in PBS w/v

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References

  1. Scoutern, C. W., O'Connor, R., Cunningham, M. Perfusion fixation of research animals. Microsc. Today. 14, 26-33 (2006).
  2. Cunningham, M. G., Connor, C. M., Zhang, K., Benes, F. M. Diminished serotonergic innervation of adult medial prefrontal cortex after 6-OHDA lesions in the newborn rat. Brain Res. Dev. Brain Res. 157, 124-131 (2005).

Comments

3 Comments

  1. Thank-you for posting this video. Your device seems to work well with small tissue, but what do you use for freezing whole adult rat brains? Is the powdered dry ice method sufficient alone to reduce freezing artifact if you are freezing a whole adult brain? Do you have an alternative procedure for these applications?   Much appreciated,
    Neil

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 23, 2008 - 4:04 AM
  2. Hi Neil, you actually can get a pretty good freeze with finely powdered dry ice. Just cover and let freeze for 3-5 minutes.  I would recommend, however, immersing the whole brain in isopentane that has been chilled (~30 minutes) in dry ice.  Just leave the brain in isopentane for 30 seconds, otherwise it can distort and fracture.  You will then need to let the (very cold, -80 degrees) brain equilibrate (warm up) to your cryostat or microtome temperature in order for it to cut smoothly.
    Good luck!
    Miles

    Miles G. Cunningham, MD PhD
    Director, Laboratory for Neural Reconstruction
    Administrative Director, McLean Fellowship in
    Neuropsychiatry and Behavioral Neurology
    Chair, ANPA Programs Committee
    Executive Director, Asniya, Inc.
    MRC 333, McLean Hospital
    Harvard Medical School
    115 Mill Street
    Belmont, MA  0²478
    office:     617.855.²051
    fax:         617.855.3199
    page:      617.855.²000

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 24, 2008 - 5:18 PM
  3. Thanks for this very helpful video. I'm interested in knowing where you purchased the freezing rod and ring that is used to form the sample mold. Alternatively what metal is the rod made of and is there any significance to the length of the freezing rod used?

    Reply
    Posted by: Ellen Y.
    April 23, 2010 - 3:57 PM

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