Author Produced

Self-Made sitospin Aparatı kullanarak İnsan Pluripotent Kök Hücre İmmünositokimyasal Analizi

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Gözlem ve ölçümü için bir tek tabaka hücreleri oluşturmak için bir self-made sitospin cihazların kullanımı dayalı, insan pluripotent kök hücreleri hücre yüzey belirteçleri için Süspansiyon immünositokimyasal boyama (hPSCs) (SSEA-3/SSEA-4) elde edildi.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Pascual, E. Y., Riggs, M. J., Rao, R. R. Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus. J. Vis. Exp. (38), e1944, doi:10.3791/1944 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Insan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve insan kaynaklı pluripotent kök hücreleri (hiPSCs) İnsan pluripotent kök hücreleri (hPSCs) sınırsız kendini yenileme yetenekleri ve çok sayıda hücre tipleri ayırt etmek için potansiyel nedeniyle heyecan verici hücre kaynaklarıdır. HPSCs pluripotent devlet qPCR, immünsitokimya gibi teknikler genellikle değerlendirilen ve diğer

Protocol

Bölüm 1: Süspansiyon İmmünositokimyasal Boyama

  1. Hücreler tek bir hücre süspansiyonu hasat edilir.
  2. Bu hücreler daha sonra 1.5 2mL mikrosantrifüj tüpler aktarılır ve 200g 4 dakika santrifüj.
  3. Hücreler supernatant dışarı aspire tarafından yıkanır, PBS 1mL yeniden askıya - (Mg 2 olmadan + ve Ca 2 +) ve sonra 4 dakika için 200 gr tekrar santrifüj. Bu iki kez yapılmalıdır.
  4. Yıkadıktan sonra, hücreler daha sonra yeniden askıya onlara 10 dakika boyunca oda sıcaklığında 1 ml% 4 paraformaldehid (PFA) tarafından sabitlenir.
  5. Hücreler iki kez 1ml PBS tekrar yıkanır.
  6. Yıkama, blok hücreleri sonra yeniden askıya Blok Çözüm 1 ml (% 6 serum/94% PBS). 45 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
  7. 200 gr az 4 dakika sonra, tüpler santrifüj ve Blok Çözüm aspirat. Primer antikor çözeltisi (Blok Çözüm tavsiye seyreltme ile yapılan) 1ml hücreleri yeniden askıya. Hücreler ya 1 saat veya 4 ° C'de bir gece bir sonraki adıma geçmeden önce oda sıcaklığında inkübe edilebilir.
  8. Hücreler daha sonra Blok Çözüm 1mL ile iki kez yıkanır.
  9. Sekonder antikoru çözümü (tavsiye edilen seyreltme Blok Çözüm ile yapılan) ve oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe 1mL hücreleri yeniden askıya sonra.
  10. 1 saat sonra, hücreler daha sonra Blok Çözüm 1mL ile iki kez tekrar yıkanmış olmalıdır.
  11. Blok Çözüm ile yıkadıktan sonra, 1 ml PBS ile tekrar hücreleri yıkayın.
  12. Çeşitli yıkar sonra, 1 ml hücrelerin yeniden askıya DAPI nükleer leke (PBS içinde DAPI 1:10,000 seyreltme -) ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
  13. 5 dakika sonra, 4 dakika için 200 gr tüpler santrifüj. - 1 ml PBS DAPI nükleer leke çözüm ve yeniden askıya hücreleri aspire.

HPSCs Incorporation Bölüm 2: sitospin aparatı sayesinde üretilen slaytlar

  1. Plastik slaytlar, bir matkap basın delik istenilen miktarda yaparak hazırlanıyor. Kullanılmak üzere geniş çaplı mikropipet ucu (ler) den en fazla 1 mm daha geniş çaplı olması gerekir.
  2. Filtre kağıdı, makas ile plastik slayt parametreleri kesilir.
  3. Delik sonra filtre kağıdı yapılır. Deliğin boyutu (ler) mikropipet ucu (ler) aracılığıyla snuggly oturduğundan emin yeterince büyük olmalıdır.
  4. Sonra, hazırlanan plastik slaytlar bir üst ve alt kesilmiş filtre kağıdı (Şekil 1) yerleştirilmiş bir cam slayt üzerine yerleştirilir. Katmanları bant ile sabitlenir.
  5. Bölüm 1 lekeli hücre süspansiyonu 100μL maksimum (istenilen tek tabaka yoğunluğuna bağlı olarak) daha sonra mikropipet ucu (lar) üstüne yerleştirilir.
  6. Gerekirse, cihazı hücre çözümü ile tartılır ve benzer ağırlıkta bir karşı denge oluşturulmuş.
  7. Sitospin aparatı ve dengelemek sonra bir masaüstü santrifüj yerleştirilir ve 200g 4 dakika santrifüj yapabilirsiniz.
  8. Santrifüj sonra, sitospin aparat dikkatle cam slayt hücreler yerinden doesnt bir şekilde demonte.
  9. Gerekirse, aşırı çevreleyen PBS - cam tarafında aspire.
  10. Hücreler daha sonra istediğiniz hücreye tek tabaka elde edilip edilmediğini kontrol etmek için bir floresan mikroskop kullanılarak görülebilir.

Bölüm 3: Montaj slaytlar

  1. Bir damla istenen montaj medya hücreleri içeren her bölgenin merkezinde yer almaktadır.
  2. Sonra, mümkünse hava kabarcıklarını önlemek için çalışıyoruz Slaytlarınıza bir kapak kayma yavaşça indirilir.
  3. Aşırı montaj medya sonra slayt kaldırılır.
  4. Sonra, kapak fişleri iki tırnak cilası ile mühürlenir.
  5. Slaytlar sonuçları gözlemlenen ve belgelenen kadar karanlık bir depolama alanı saklanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Laboratuvar amaçları için, 35mm, fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) yetişen kök hücre kültürleri bir çanak immünositokimyasal boyama prosedürü için sitospin aparatı ile kullanım için ayrılmıştır. Hücreler daha sonra bir tek hücre süspansiyonu, MEF katmanı mümkün olduğu kadar çok kaldırarak, Pasajlanması enzimatik yoluyla tahsil edilir. MEF katman daha etkili kök hücre izolasyonu isteniyorsa, koloniler elle süspansiyon içine sindirilmiş sonra aldı olabilir. Besleyici ücretsiz koşulları kök hücre kültürleri büyüyen kullanılırsa, koloniler sadece kazınmış ve süspansiyon içine sindirilmiş olabilir. Ilk tek hücreli bir süspansiyon ideal olsa da, herhangi bir hücre kümeleri immünositokimyasal boyama işlemi olarak adlandırılan çok sayıda yıkama ve yeniden süspansiyon adımları boyunca etkili parçalarına ayrılmış olmalıdır.

Video boyama hPSCs için ekstrasellüler belirteçlerin kullanımı üzerinde duruldu. HPSCs intraselüler boyanması isteniyorsa, Blok Çözüm toplamadan önce (Adım 1.6) ek bir adım hücreleri Permeabilization Çözüm 1 ml yıkanır neyin (Tween 20 25μL Yüksek Tuz Tampon 50mLs) üç kez yapılması gerekir önce yeniden askıya Blok Çözüm. Bir diğer kritik nokta belirtilmelidir prosedürü 1.9 Adım floresan ikincil antikor DAPI nükleer ağartma ve leke önlemek için numune ışığa maruz kalma en aza indirilmesinde, bakım alınması gerektiğini.

Çünkü çok sayıda yıkama ve prosedürü yeniden süspansiyon adımları, yaklaşık 400k-600k hücreleri olduğu tahmin geçit hazır kök hücre kolonileri, iyi bir miktarı ile bütün bir 35mm çanak, ilk süspansiyon sindirilmiş olması önerilir ve kullanılır . Bu prosedürün doğası nedeniyle bazı hücre kaybı beklentisiyle yapılır. Teorik olarak, hücreler çok daha küçük bir miktarı ilk süspansiyon kullanılan olabilir, ancak bakım, fazladan bir miktar daha fazla hücre kaybını en aza indirmek için alınması gereken. Immünositokimyasal boyama prosedüründen sonra sitospin aparat üzerine yüklerken, 10k-50k bir hücre yoğunluğu idealdir. Ideal bir hücre yoğunluğu içeren önerilir 100μL 0.1μL 10μL mikropipet ucu kullanan bir Cytopsin aparat üzerine yüklenebilecek maksimum miktar, daha küçük bir miktarı (yaklaşık 30μL 20μL) ise, belirtilmelidir. Bu cam slayt üzerine sıvı gereksiz taşması en aza indirir. Son olarak, santrifüj sitospin cihazları kullanırken, uzun aparat, lateral hareket, kuvvet, bildiğimiz kadarıyla, çalışırken santrifüj tarafından oluşturulan saygısız veya düşme aparat tutmak yeterli güvenli olarak.

Immünositokimyasal prosedüründe kullanılan çözümler için Malzemeler:

  1. % 2 Paraformaldehit (PFA) / 2% Sakkaroz
    1. 75 ml distile su ve yer ekle ısıtmalı heyecan plaka üzerinde 56 ° C
    2. 2 g PFA tartılır ve cam beher ekleyin.
    3. 2 g sakaroz tartılır ve cam beher PFA eklemek.
    4. 1M sodyum hidroksit 2 damla ekleyin.
    5. Tüm reaktifler çözüm içine geçti sonra, 10 ml 10X PBS eklemek + +.
    6. PH 7,2-7,4 için çözüm ayarlayın.
    7. 100 ml saf su ile hacim kazandırın.
      Saklayınız 4 ° C ve 1 hafta içinde kullanmak. @ -20 ° C Alikot 1 ay saklanabilir. Herhangi bir çökelti kaldırmak için çözülme sonra kısaca santrifüjleyin.
  2. Blok Çözümü (10 ml)
    1. 9.4 ml PBS ekle.
    2. PBS için 0.6 ml serum ekle. (Bu her bir antikor için optimize edilmesi gerekebilir.)
      Saklayınız 4 ° C ve 48 saat içinde kullanılacak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

NSF KARİYER 0744556 (Rao) ve VCU HHMI Bilim Eğitim ve Araştırma Programı (Pascual) aracılığıyla burs tarafından bu iş için kısmi finansman sağlandı.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lab Tek Permanox Chamber Slide Thermo Fisher Scientific, Inc. 117437 Material for re-used plastic slides
Superfrost/Plus Microscope Slides Precleaned Fisher Scientific 12-550-15
0.1-10μL Filter Tips USA Scientific, Inc. 1121-3810
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 120542-B
Cytoseal 280 Richard-Allan Scientific 8311-4 Mounting Medium
DPBS GIBCO, by Life Technologies 14190
Normal Goat Serum Invitrogen 10000C
Mouse Anti-SSEA-4 Monoclonal Antibody EMD Millipore MAB4304 Primary Antibody for SSEA-4 staining
Rat Anti-SSEA-3 Monoclonal Antibody EMD Millipore MAB4303 Primary Antibody for SSEA-3 staining
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG Invitrogen A11029 Secondary Antibody for SSEA-4 staining
Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG Invitrogen A11006 Secondary Antibody for SSEA-3 staining
DAPI, Dihydrochloride Calbiochem 268298

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. Cell surface markers in human embryonic stem cells. Methods in Mol. Bio. - Stem Cell Assays. 407, 51-61 (2007).
  2. Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R. A homemade cytospin apparatus. Anal. Biochem. 359, 283-284 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics