셀룰러 Lysates에서 Multiprotein의 단지의 분석을 위해 블루 기본 Polyacrylamide 젤 전기 영동 (BN - PAGE)

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Summary

이 비디오에서는, 우리는 푸른 원시의 polyacrylamide 겔 전기 영동 (BN - PAGE)에 의해 multiprotein의 단지 (MPCs)의 특성을 설명합니다. 첫 번째 차원에서 dialyzed 세포 lysates은 개별 MPCs을 식별할 BN - PAGE로 구분됩니다. 두 번째 차원 SDS - PAGE에 관심 MPCs은 더욱 immunoblotting하여 성분을 분석하기 위해 세분화됩니다.

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Fiala, G. J., Schamel, W. W. A., Blumenthal, B. Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates. J. Vis. Exp. (48), e2164, doi:10.3791/2164 (2011).

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Abstract

대부분의 단백질이 다른 단백질과 기능이나 규제 단지 (살리, Glaeser 외. 2003)에서 찾을 수 있으므로 Multiprotein의 단지 (MPCs)은 세포 신호 전달에 중요한 역할을한다. 따라서, 단백질 - 단백질 상호 작용 네트워크의 연구는 단백질 기능과 규정의 통합 이해를 얻을 수 MPCs의 세부 특성이 필요합니다. 식별 및 분석을 위해, MPCs는 기본 조건 구분해야합니다. 이 비디오에서는, 우리는 푸른 원시의 polyacrylamide 겔 전기 영동 (BN - PAGE)에 의해 MPCs의 분석을 설명합니다. BN - PAGE은 젤 여과 또는 자당 밀도 ultracentrifugation에 의해 제공되는보다 높은 해상도와 고유의 형태에 MPCs의 분리를 허용하고, MPC 크기, 구성, 그리고 상대적으로 풍부 (Schägger 및 본 Jagow 1991)를 결정하는 것이 유용합니다 기술입니다 ; (Schägger, 크래머 외 1994.). 이 방법으로 단백질들은 유체 크기와 polyacrylamide의 매트릭스에 형태에 따라 구분됩니다. 여기, 우리는 lysate 투석은 BN - PAGE 이러한 생물 학적 샘플에 적용을하는 중요한 단계입니다 지적, 전체 세포 lysates의 MPCs의 분석을 보여줍니다. 첫째 차원 BN -와 두 번째 차원 SDS - PAGE의 조합을 사용하여, 우리는 BN - PAGE로 구분 MPCs이 더욱 SDS - PAGE에 의해 그들의 개인적인 성분으로 세분화 될 수 보여줍니다. 겔 분리시 MPC 구성 요소의 시각화 표준 immunoblotting에 의해 수행됩니다. BN - PAGE에 의해 MPC 분석을위한 예를 들어, 우리는 잘 특징 진핵세포 19S, 20 대, 그리고 26S proteasomes를 선택했습니다.

Protocol

Multiprotein의 단지의 확인 및 분석을위한 블루 기본 Polyacrylamide 젤 전기 영동 (BN - PAGE) : **이 비디오 프로토콜은 관련 출판 일을 기반으로합니다. Mahima 스와미, 가브리엘 M. Siegers, 수자 Minguet, 번드 Wollscheid, 그리고 볼프강 WA Schamel. 과학의 STKE 2006 (345) : pl2, 2006년 7월 25일, [간접 : 10.1126/stke.3892006pl4]. 본 자료를 보시려면 여기를 클릭하십시오 .

1. dialyzed 세포 lysate의 준비

  1. 4 5 분 350g에 원심 분리하여 수확 10x10 6 셀 및 펠릿 ° C.
  2. 얼음처럼 차가운 PBS (조리법 1) 1 ML과 세포 펠렛을 세 번 씻어 단계 1.1에서와 같이 원심 분리기.
  3. Resuspend 얼음처럼 차가운 BN - 용해 완충액 (제조법 2) 250 μL에 펠렛과 15 분 얼음에 품어.
  4. 4 15 분 1만3천그램에서 원심 분리기는 ° C는 불용성 물질을 제거합니다.
  5. 파스퇴르 피펫의 온수 큰 직경 측면을 사용하여 1.5 - ML의 microcentrifuge 관 뚜껑에 구멍을 용해 후 4 ° C. 아래로 냉각 얼음에 튜브를 삽입
  6. 뚜껑에있는 구멍과 냉각 튜브로 단계 1.4에서 뜨는을 전송합니다.
  7. 닫기 열린 튜브 상단의 뚜껑에 집게와 투석 막 (10 KD의 분자량 컷 - 오프) 장소 밖 스틱 초과 투석 막 잘라.
  8. Parafilm와 함께 신중하게 측면에 뚜껑을 밀봉합니다.
  9. 튜브를 반전 4에서 10 초위한 세포 배양 원심 분리기에서 50 ML 원뿔 튜브 가능 최저 속도로 거꾸로 원심 분리기 ° C. 최대 튜브 오른쪽 측면을 전환하지 않도록 핀셋을 사용하여 원심에서 거꾸로 튜브를 제거합니다.
  10. 추위 BN - 투석 버퍼 (제조법 3)와 저어 플레이트와 100 ML 비커를 준비합니다. 100 μL 시료 당 BN - 투석 버퍼의 최소 10 ML을 사용합니다.
  11. 부착 거꾸로 비커 내부 테이프와 튜브, 그리고 구부러진 파스퇴르 피펫을 사용하여 뚜껑 아래 구멍에서 기포를 제거합니다.
  12. 자석 활동가 위에 플레이스 비커는 활동가 스위치 6 시간 또는 차가운 방에서 하룻밤을 위해 두십시오. 감동이 투석 막에서 공기 방울을 생성하지 않도록 가끔 확인하십시오.
  13. 새로운 냉장 microcentrifuge 관에서 dialyzed 세포 lysate를 수집합니다.

2. 의 용탕 주입 BN - 젤

  1. 붓는 그라데이션 젤은 그라디언트 믹서와 함께 실온에서 이루어집니다. polyacrylamide 높은 neurotoxic 때문에 장갑을 착용해야합니다. SDS와의 접촉을 피하십시오.
  2. 저어 접시에 그라디언트 믹서를 삽입하고 유연한 튜브의 한 부분에 첨부해 주시기 바랍니다. 밸브를 사용하여 채널을 닫고 클램프로 튜브를 닫습니다. 튜브에 연결된 "높음"실린더에 자기 활동가에게 15 %를 놓으십시오.
  3. peristalitic 펌프로 유연한 튜브를 스레드와 끝까지 주사기 바늘을 연결합니다. 그런 다음 젤 장치의 두 유리 접시 사이에 바늘을 넣으십시오.
  4. 4퍼센트 (조리법 5) 15 % (제조법 6), 젤 솔루션을 분리 APS를 추가하고 사용하기 전에 바로 TEMED를 준비합니다. 통합 볼륨 분리 젤의 볼륨과 동일해야합니다.
  5. 그라디언트 믹서의 해당 실린더 (이하 "낮은"로 4%하고 "높은"실린더로 15 %)로이 젤 솔루션을 붓고.
  6. 엄지로 왼쪽 실린더 이상 눌러 두 겔 저수지를 연결하는 채널 내부의 기포 밖으로 밸브와 강제를 엽니다.
  7. 자기 활동가 스위치, 클램프를 제거하고, 분당 5 ML에 peristalitic 펌프 스위치. 젤 천천히 유리 플레이트 사이의 흐름을 허용합니다. 바늘이 액체 위에 항상 확인하십시오.
  8. 모든 액체가 젤 장치를 입력할 수 있도록 허용하고 이소프로판올와 함께 부드럽게 오버레이. 젤 실온에서 최소 30 분 중합 수 있습니다.
  9. DH 2 O (세제를 사용하지 마십시오)와 즉시 쏟아져 장치를 청소합니다.
  10. 이소프로판올 제거 DH 2 O로 씻어 및 왓먼 종이와 DH 2 O를 제거합니다.
  11. , 3.2 % 스태킹 젤 (제조법 7) 준비 APS를 추가하고 사용하기 전에 바로 TEMED.
  12. 분리 젤 위에 쌓아 젤 붓고하고 거품을 피하기 위해, 유리 접시 사이 빗을 소개합니다. 스태킹 젤 polymerized 후 4 ° C.를 젤 진정
  13. 즉시 샘플 로딩 전에 젤의 비행기 각도에서 그것을 꺼내 천천히 빗를 제거합니다. 이것은 우물의 품질을 향상 빠르게 주머니를 입력하기 위해 공기 수 있습니다.

3. BN - PAGE에 의해 dialyzed 세포 lysate의 분리

  1. 4 마른 우물에 dialyzed lysate의 1-40 μL 및 마커 믹스의 10-20 μl (제조법 10) 부하 ° C. 차가운 음극의 버퍼 (제조법 8) 각 우물에 샘플을 중첩.
  2. 감기 고양이와 내부 챔버를 채우감기 양극 버퍼로 hode 버퍼와 하단 / 외부 챔버 (비법 9).
  3. 샘플이 분리 젤를 입력 때까지 minigel 또는 대형 젤로 150V 100 V를 적용할 수 있습니다. 4 젤을 실행 ° C.
  4. 180 V (minigel) 또는 400 V (대형 젤)에 전압을 향상시키고 염료 앞에는 젤의 끝에 도달할 때까지 실행합니다. 실행을위한 3~4시간 소요 소형 및 대형 젤에 대한 18~24시간.

4. 두 번째 차원 SDS - PAGE

  1. 이 dialyzed lysate의 나누어지는에 대한 첫 번째 차원 BN - PAGE 레인, 분자량 마커 한 정기 차선, 한 일반 차선에 대해 하나의 큰 레인있는 표준 10% SDS - 젤 (조리법 12-15)를 준비 SDS 샘플 버퍼 (제조법 11)과 함께 혼합하고 95 ° C.에서 5 분 삶아되었습니다 누구의 두께 SDS 겔에 BN - PAGE 젤 슬라이스의 로딩을 단순화하기 위해 스카치 테이프의 두 레이어에 의해 증가되었다 스페이서를 사용합니다.
  2. 전기 영동 장치에서 접시에 BN - PAGE 젤을 제거하고 부드럽게 한 접시를 캐내다.
  3. 스태킹 젤를 제거하고 관심의 단백질을 포함하고있는 BN - PAGE 젤의 차선을 잘라 버릴거야.
  4. 상온 10 분 2X SDS 샘플 버퍼와 부화에 BN - PAGE 젤 슬라이스를 놓습니다.
  5. 전자렌지에 BN - PAGE 젤 슬라이스 간단히를합니다 (20 개 이상의 초) 보일.
  6. 상온에서 또 다른 15 분에 대한 뜨거운 SDS 샘플 버퍼에있는 BN - PAGE 젤 슬라이스를 품어.
  7. SDS - PAGE 젤 피하고 공기 방울, 그리고 오버레이 SDS 샘플 버퍼로 슬라이스의 스택 젤 위에 잘 대형에있는 BN - PAGE 젤 슬라이스를로드합니다. 마커 및 lysate 컨트롤을로드합니다.
  8. 표준 프로토콜에 따라 전기 영동을 수행합니다.

5. immunoblotting하여 MPC의 subunits의 감지

  1. 전송을위한 여섯 왓먼 서류 및 SDS - 젤의 크기에 맞춤 PVDF 막을 준비합니다.
  2. 30 S에 대한 100 % 메탄올에서 PVDF 막 부화 및 전송 버퍼 (제조법 16)에 왓먼 서류를 만끽해보세요.
  3. 플레이스 다시 셋을 왓먼 서류, PVDF 막, SDS - 젤 (젤 스태킹 제거), 그리고 semidry 전송 세포로 샌드위치와 같은 구조로 세 왓먼 서류.
  4. 25 분 20 V를 적용합니다.
  5. 표준 immunoblotting 프로토콜에 따라 단백질을 감지합니다.

6. 대표 결과

우리는 2D BN / SDS - PAGE (그림 1A)에 의해 MPC 특성화를위한 진핵세포 19S, 20 대, 그리고 예를 들어 26S proteasomes의 분석을 제시한다. HEK293 세포는 0.1 %를 포함하는 버퍼 lysed되었습니다 튼​​과 세포막을 방해하고 막 단백질 단지를 solubilize하는 세제로 X - 100. 이러한 lysates은 소금 작은 metabolites를 제​​거하는 BN - 투석 버퍼에 대한 dialyzed되었습니다. 그런 다음, MPCs는 두 번째 차원 SDS - PAGE 다음 4-15% 기울기 BN - PAGE에 의해 분리되었다. 단백질은 proteasome subunits 20 대의 β2 및 Mcp21에 대한 항체와 immunoblotting하여 시각되었습니다.

그림 1
그림 1. 세포 lysates를 사용하여 2 차원 BN-PAGE/SDS-PAGE 접근. 세포 lysates에서 2D BN-PAGE/SDS-PAGE 접근의 (A) 흐름 다이어그램. 2D BN-PAGE/SDS-PAGE의 (B) 도식 제도. 단백질과 MPCs은 첫 번째 차원의 BN - PAGE에 의해 기본 조건 하에서 구분됩니다. 두 번째 차원 들어, 단백질 및 / 또는 MPCs는 BN - PAGE에 의해 분리 후 겔 스트립에서 SDS에 의해 변성하고 이후 SDS - PAGE를 받게. Monomeric 단백질은 첫 번째에있는 그라데이션 젤하고 두 번째 차원의 선형 젤로 쌍곡선 대각선으로 인해로 마이 그 레이션됩니다. 한 콘크리트 MPC의 구성 요소는 수직선에 위치하고 있으며, 대각선 아래 찾을 것입니다.

그것은 첫째 차원 BN -와 두 번째 차원 SDS - PAGE의 조합에 의해, monomeric 단백질은 두 번째 차원 (의 첫 번째와 선형 겔에서 그라디언트 젤로 인해 쌍곡선 대각선 이내에 마이 그 레이션하는 것으로 나타났습되었습니다 (카마초 - Carvajal, Wollscheid 동부 표준시 알 2004);. 그림 1B). MPCs의 구성 요소는이 대각선 아래에 위치하고 있습니다. 수평선에서 동일한 단백질의 여러 명소가 여러 독특한 MPCs에있는 단백질의 존재를 나타내는 반면 같은 MPC의 subunits를 나타내는 단백질은 두 번째 차원에서 한 수직선에서 찾을 수 있습니다. 우리의 실험에 β2 및 Mcp21에 대한 immunoblotting 그림 2 보여줍이 proteasomal subunits를 포함하는 특정 단백질 단지의 존재를 공개했다. 두 단백질은 β2 및 Mcp21 여러 독특한 MPCs의 성분을 나타내는 것을 나타내는 수평선에 배치 각각의 장소로 감지되었다. 이러한 MPCs은 명확하게 규제 subunit PA28 함께 proteasome 20 대 (20 대 플러스 19S 뚜껑) 26S proteasome로 식별하고, 20 대 자신의 크기와 구성을 바탕으로, 혼자 proteasomes 수 있습니다. 함께 촬영이 열매가 나타나고타우 내생 MPCs은 세포 lysate를 사용하여 2 차원 BN-PAGE/SDS-PAGE 접근에 의해 식별하고 특징 수있다는 것을 보여준다. 이 방법은 크기, 구성, 그리고 MPCs의 상대적인 풍요의 결정에 대해 적용됩니다.

그림 2
그림 2. 2 차원 BN-PAGE/SDS-PAGE 후 immunoblotting하여 진핵세포 proteasome. 진핵세포 proteasomes의 식별 및 분석을 위해 다양한 형태의 검색은 HEK293 세포는 0.1 % 트리톤 X - 100 lysed되었습니다. 셀룰러 lysates은 dialyzed하고 이후 별도의 MPCs로 BN - PAGE (4~15%)를 받게되었습니다. 이후, 두 번째 차원 SDS - PAGE (10 %)는 개별 하위 구성 요소의 크기 분리에 대해 실행되었습니다. Immunoblotting는 Mcp21과 20 대 핵심 복합 β2 subunit, 그리고 규제 subunit PA28을 인식 특정 항체와 함께 수행했다.

특정 시약의 I. 테이블 (알파벳 순서) :

시약 회사 댓글
6 - aminohexanoic 산성
(ε - aminocaproic 산성)
시그마 - 알드리치, Taufkirchen, 독일 이 화학 물질은 자극이며 장갑으로 취급해야합니다.
아크릴 아미드 - bisacrylamide 용액 (40 %), 혼합 32:1 Applichem, 다름슈타트, 독일 이 솔루션은 neurotoxic하고 장갑으로 취급해야합니다.
비스 - 트리스 로스, 카를 스루에, Germa - NY
Brij 96 시그마 - 알드리치, Taufkirchen, 독일
쿠매시 블루 G250 Serva, 하이 델베르크, 게르 - 많은 이러한 쿠매시 블루 R250이나 콜로이드 쿠 - 매시 블루스로 쿠매시 염료의 다른 유형을 대체하지 마십시오.
Digitonin 시그마 - 알드리치, Taufkirchen, 독일 Digitonin 독성이 있습니다. 버퍼 또는 억제 - 젠트를 포함하는 샘플을 다룰 때 장갑을 착용하여야한다.
Dodecylmaltoside Applichem, 다름슈타트, 독일
트리톤 X - 100 로스, 카를 스루에, Germa - NY 트리톤 X - 100은 독성이있다. 버퍼 또는 세제를 포함하는 샘플을 다룰 때 장갑을 착용하여야한다.

II. 특정 재료와 장비의 테이블 :

장비 회사
투석 점막 (분자량 컷 - 오프 10-50 KD) 로스, 카를 스루에, 독일
겔 전기 영동 시스템 바이오 래드, 뮌헨, 독일의 예를 들면
그라데이션 믹서 자체 제작 또는 바이오 래드, 뮌헨, 독일에서 상용
연동 펌프 애머스햄 Pharmacia 생명 공학, 프라이 부르크, 독일
Polyvinylidene difluoride (PVDF) 막 Immobilon - P, Millipore, Eschborn, 독일
세미 드라이 전송 장비 바이오 래드, 뮌헨, 독일의 예를 들면
실리콘 튜브 (3~5밀리미터 직경 1 미터 길이) NeoLab, 하이 델베르크, 독일

III. 조리법 표 :

번호 버퍼 및 솔루션 내용 댓글
1 인산 버퍼 살린 (PBS) 2 HPO 4 8.1 mMKH 2
PO 4 1.5 MM
NaCl 138 MM
KCl 2.7 MM
제대로 예약 앞에 서있다면 해결책은 산도 7.4 있어야합니다.
2 BN - 용해 완충액 베이스 버퍼
비스 - 트리스 20 MM
ε - aminocaproic 산성 500 MM
NaCl 20 MM
EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8.0이 MM
글리세롤 10%

HCL과 7.0 산도를 조정합니다. 4 스토어 ° C.

세제
Digitonin 0.5-1.0 %
또는 Brij 96 0.1-0.5 %
또는 트리톤 X - 100 0.1-0.5 %
또는 Dodecylmaltoside 0.1-0.5 %

단백 분해 효소 및 인산 가수 분해 효소 억제제
Aprotinin 10 μg / ML
류펩틴 10 μg / ML
PMSF 1 ㎜
나트륨 불화 0.5 MM
나트륨 orthovanadate 0.5 MM
적절한 세제는 경험적으로 결정되어야하며 다른 용해 버퍼 조리법에 사용되는 것과 동일해야합니다.

Digitonin 단지 DH 2 O (-20에서 5 ML의 aliquots에 저장 ° C)에서 2 % 주식 솔루션에서 사용하기 전에 추가해야합니다.

단백 분해 효소 억제 및 phophatase - ors은 즉시 사용하기 전에 추가되어야합니다.

나트륨 orthova - nadate의 추가되면 버퍼는 색상 노란 될 것입니다.
3 BN - 투석 버퍼 베이스 버퍼
비스 - 트리스 20 MM
ε - aminocaproic 산성 500 MM
NaCl 20 MM
EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8.0이 MM
글리세롤 10%

HCL과 7.0 산도를 조정합니다. 4 스토어 ° C.

세제
Digitonin 0.3-0.5 %
또는 트리톤 X - 100 0.1 %
또는 Brij 96 0.1 %
또는 Dodecylmaltoside 0.1 %

단백 분해 효소 및 인산 가수 분해 효소 억제제
PMSF 1 ㎜
나트륨 orthovanadate 0.5 MM
적절한 세제는 경험적으로 결정되어야하며 다른 용해 버퍼에서 사용되는 것과 동일해야하지만,에 집중하고 낮은 - tions를 지적했다.

세제는 겔 전기 영동의 스택 단계에서 사전 환기 집합에 추가합니다.

단백 분해 효소 억제 및 phophatase - ors은 즉시 사용하기 전에 추가되어야합니다.
4 배 BN - 젤 버퍼 비스 - 트리스 150 MM
ε - aminocaproic 산성 200 MM

HCL과 7.0 산도를 조정합니다. 4 스토어 ° C.
5 4 % 젤 분리 배 BN - 젤 버퍼 (제조법 4) 5.00 ML
아크릴 아미드 / Bisacrylamide 1.50 ML
DH 2 O 8.50 ML
APS, DH 2 O 54 μL에서 10 %
TEMED 5.4 μL
이 시약은 중합을 촉진 등 immedia - tely 젤 쏟아져 전에 APS와 TEMED를 추가합니다.

이 요리법은 30 ML 젤을 행사할 충분하다. 부어되는 젤의 수와 크기 볼륨을 조정합니다.
6 15 % 젤 분리 배 BN - 젤 버퍼 (제조법 4) 5.00 ML
아크릴 아미드 / Bisacrylamide 5.63 ML
글리세롤 70% 4.38 ML
APS, DH 2 O 42 μL에서 10 %
TEMED 4.2 μL
이 시약은 중합을 촉진 등 immedia - tely 젤 쏟아져 전에 APS와 TEMED를 추가합니다.

이 요리법은 30 ML 젤을 행사할 충분하다. 부어되는 젤의 수와 크기 볼륨을 조정합니다.

아크릴 아미드 - bisacrylamide의 농도도 10~18%에서 필요에 따라 다양한 수 있습니다.
7 3.2 %가 젤 스태킹 배 BN - 겔 버퍼 (제조법 4) 3.00 ML
아크릴 아미드 / Bisacrylamide 0.72 ML
DH 2 O 5.28 ML
APS, DH 2 O 120 μL에서 10 %
TEMED 12 μL
이 시약은 중합을 촉진 등 immedia - tely 젤 쏟아져 전에 APS와 TEMED를 추가합니다.

이 요리법은 30 ML 젤을 행사할 충분하다. 부어되는 젤의 수와 크기 볼륨을 조정합니다.
8 음극 버퍼 비스 - 트리스 15 MM
Tricine 50 MM
쿠매시 블루 G250 0.02 %

10X 주식으로 1리터 준비, 4 HCL와 7.0 산도를 조절하고, 저장 ° C.
사용하기 전에 DH 2 O와 1시 10분을 희석.
이러한 쿠매시 블루 R250이나 콜로이드 쿠매시 블루스로 쿠매시 염료의 다른 유형을 대체하지 마십시오.
9 양극 버퍼 비스 - 트리스 50 MM

10X 주식으로 1리터 준비, 4 HCL와 7.0 산도를 조절하고, 저장 ° C.
사용하기 전에 DH 2 O와 1시 10분을 희석.
10 마커 믹스 Aldolase (158 KD) 10 MG / ML
카탈 라 아제 (232 KD) 10 MG / ML
페리틴 (440 및 880 KD) 10 MG / ML
Thyroglobulin (670 KD) 10 MG / ML
BSA (66 132 KD) 10 MG / ML
비스 - 트리스 20 MM
NaCl 20 MM
글리세롤 10%

HCL과 7.0 산도를 조정합니다. 4 스토어 ° C.
분자량 마커는 Invitro - 젠 또는 Pharmacia 포함한 여러 소스로부터도 상업적으로 사용할 수 있습니다.
11 SDS 샘플 버퍼 트리스 12.5 MM
SDS 4%
글리세롤 20%
Bromophenol 블루 0.02 %

6.8으로 산도를 조정합니다. 이황화 채권을 줄이기 위해, 9 ML β - 메르 캅 토 에탄올을 추가합니다.
가루와 β - 메르 - captoethanol로 SDS는 독성이있다. 따라서, 장갑을 사용하여 후드를 작동합니다.
12 4X 낮은 버퍼 트리스 1.5 M
SDS 0.4 %

8.8으로 산도를 조정합니다.
가루로 SDS는 독성이다. 따라서, 장갑을 사용하여 후드를 작동합니다.
13 4X 상단 버퍼 트리스 0.5 M
SDS 0.4 %

6.8으로 산도를 조정합니다.
가루로 SDS는 독성이다. 따라서, 장갑을 사용하여 후드를 작동합니다.
14 10 % 젤 분리 아크릴 아미드 (30 %) 2.0 ML
4X 낮은 버퍼 1.5 ML
DH 2 O 2.454 ML
APS, DH 2 O 40 μL에서 10 %
TEMED 6 μL
이 시약은 중합을 촉진 등 immedia - tely 젤 쏟아져 전에 APS와 TEMED를 추가합니다.

이 요리법은 30 ML 젤을 행사할 충분하다. 부어되는 젤의 수와 크기 볼륨을 조정합니다.
15 4.8 %가 젤 스태킹 Acylamide (30 %) 320 μL
4X 상단 버퍼 500 μL
DH 2 O 1.16 ML
APS, DH 2 O 10 % 20 μL
TEMED 2 μL
이 시약은 중합을 촉진 등 immedia - tely 젤 쏟아져 전에 APS와 TEMED를 추가합니다.

이 요리법은 30 ML 젤을 행사할 충분하다. 부어되는 젤의 수와 크기 볼륨을 조정합니다.
16 Semidry 전송 버퍼 트리스 48 MM
글리신 39 MM
메탄올 20%
SDS 0.1 %

DH 2 O.과 1리터로 볼륨을 조정 상온에서 보관하십시오.
분말과 메탄올로 SDS는 독성이있다. 따라서, 장갑을 사용하여 후드를 작동합니다.

Discussion

본 연구에서는, 우리는 BN - PAGE에 의해 MPCs의 분석을 설명합니다. 2D 접근이 기본 조건 첫째 별도 MPCs하는 데 사용됩니다, 그리고 추가로 두 번째 차원 SDS - PAGE하여 개별 구성 요소로 그들을 나눌 수 있습니다.

샘플은 세포 lysates의 준비가되어 있습니다. 많은 MPCs의 solubilization 들어, 적절한 세제는 단백질 단지의 구조를 유지하는, 필요합니다. 여기, 우리는 0.1 % 트리톤 X - 100을 사용합니다. 그러나, 최적의 세제와 적당한 농도는 모든 MPC에 대해 경험적으로 결정해야합니다. 의 경우에는 트리톤 X - 100, 예를 들면, 그것은 낮은 세제 농도가 F 1 dimeric 양식의 식별을 허용되는 것으로보고되었습니다 F 0 - ATPase 복합 (아놀드, 파이퍼 외. 1998). 높은 트리톤 X - 100 농도는하지만, 이합체의 분리와 monomeric F 1 F 0 - ATPase 복합 해당 증가로 이어집니다. 높은 농도 또는 다른 세제의 사용가 digitonin 결과를 불리는 반면, 이것은 과거의 연구 중 하나와 라인에, 우리는 Brij 96 낮은 농도로 추출하면 multivalent T - 세포 수용체 복합 (TCR)가 보존는 것을 보여주고 있었다 monomeric TCR의 추출 (Schamel, Arechaga 외. 2005). 테스트할 수 있습니다 일반적으로 사용되는 세제는 digitonin (0.5-1 %), 트리톤 X - 100 (0.1-0.5 %), Brij 96 (0.1-0.5 %), 또는 dodecylmaltoside을 (0.1-0.5 %) 등이 있습니다. 이 시약은 MPC의 안정성을 위해 최선이 될 경향이 nonionic 세제입니다. SDS와 다른 강한 세제과 접촉이 (카마초 - Carvajal, Wollscheid 외. 2004) 피해야한다고 알고 있습니다.

lysates의 투석은 BN - 젤의 MPC 분리 (. 카마초 - Carvajal, Wollscheid 2004) 달성하는 데 필요한, (Heiss, Junkes 외 2005.). 그것은 소금 농도 또는 낮은 분자량의 불순물의 제거의 조정은 높은 해상도를 위해 중요 것 같습니다. 또한 immunopurified 나중에 항체에서 eluted되었습니다 막 준비와 MPCs이 (스와미, Siegers 외. 2006) BN - PAGE에 적합한 것을 주목할만한 것입니다. 두 경우 모두에서, 샘플은 멤브레인 용해 또는 용출이 BN - 용해 버퍼에서 실시하는 경우, BN - PAGE 분리에 대한 dialyzed 될 필요가 없습니다.

BN - PAGE로 단백질 분리, 염료 쿠매시 파란색 단백질 unspecifically 바인딩과 부정 청구와 ​​함께 그들을 포함하는, 필요합니다. 따라서, 쿠매시 파란색 중립 PH (Schägger 및 본 Jagow 1991)에서 음극쪽으로 단백질의 전기 영 동적 이동성을 가능하게, (Schägger, 크래머 외 1994.). 또한, 쿠매시 파란색 전기 영동하는 동안 쌓아 겔의 단백질 집합을 방지합니다. BN - PAGE 들어, 쿠매시 G250은 쿠매시 청색 R250이나 콜로이드 쿠매시 블루스 대신 사용할 수 있습니다.

BN - 젤을 실행하기 전에, 그것은 젤의 비율은 관심의 MPC의 예상 크기에 맞는 것을 보장하기 위해 필요합니다. 다양한 그라디언트와 적절한 버퍼 Invitrogen (NativePAGE Novex BIS - 트리스 젤 시스템)에서 상업적으로 사용할 수로 BN - 젤을 프리 캐스트. 그러나 BN - 젤 또한 persistaltic 펌프와 함께 그라디언트 믹서를 사용하여 준비하실 수 있습니다. 손상 그라데이션을 보장하기 위해 액체가 쏟아져과 거품을 피해야한다 동안 끊임없이 유동한다. 과부하가 전기 과정 중에 단백질 침전으로 이어질 수 있기 때문에 우리는 겔에 다른 샘플 dilutions의 로딩을 권장합니다. 또한, BN - 젤은 4 실행되어야 ° C 단백질 저하를 방지하고 MPCs 그대로 유지합니다.

MPCs의 BN - PAGE, 시각화가 쿠매시 빛나는 푸른 얼룩, 실버 얼룩이나 immunoblotting하여 얻을 수있다 후에. 단백질 밴드 대량 분석계 (카마초 - Carvajal, Wollscheid 외. 2004)에 의해 더 분석에 적합합니다 쿠매시 또는 실버 얼룩의 시각. immunoblotting의 경우 관심의 MPCs에 대한 최적의 전송 상태는 경험적으로 결정해야합니다. 쿠매시 블루도 BN - 젤의 모래 바닥 동안 전송되는 점에 유의하십시오. 막이 파란 색깔을 발휘합니다 반면 따라서, 젤은 성공적인 전송 후에 무색됩니다. 또한, SDS - PAGE 후 검색을 위해 일하는 게 아니 모든 기본 항체가, BN - PAGE에 immunoblotting에 적용할 수 있다고 언급하는 것이 중요합니다. 그것은 그들의 에피토프이 단백질의 원래 형태에 숨겨져 있기 때문에 항체가 관심의 MPC를 인식하지 않는 것이 발생할 수 있습니다. 이 문제를 극복하기 위해서는 1X SDS 샘플 버퍼에 곧 젤 끓는 사전 전송 BN - 겔 내에서 단백질을 변성 수 있습니다.

우리의 예제에서는, 우리는 단백질 밴드의 검출에 직접 BN - 젤 적용되지 않았다. 대신, 우리는 추가로 두 번째 dimensi하여 BN - PAGE로 구분 lysate를 나누어SDS - PAGE에. 두 번째 차원 SDS - 겔에서 monomeric 단백질은 두 번째 차원 (카마초 - Carvajal, Wollscheid 외. 2004)의 첫 번째와 선형 겔에서 그라디언트 젤로 인해 쌍곡선 대각선 이내에 마이 그 레이션. 그들이 쌍곡선 대각선 아래화된되기 때문에 이것은, MPCs의 쉽게 확인하실 수 있습니다. 한 별개의 MPC의 하위 구성 요소는 두 번째 차원 SDS - PAGE의 수직선에서 구분됩니다. 여러 dinstinct의 MPCs의 성분 구성 요소는 MPC의 크기에 따라 수평선에서 확인할 수 있습니다. 그러나, 하나의 수직선에 나타나는 여러 가지 단백질의 명소도 BN - PAGE의 동일한 위치에서 마이 그 레이션 개별 단지의 일부가 될 수 있다고 간주되어야한다. 그들은 같은 MPC에 나타날 수있는 마지막 증거는 항체 기반 겔 변화 분석에 의해 얻을 수 있습니다. 이 분석에서는 셀룰러 lysate 전에 BN - PAGE로 확인 명소 중 하나에 의해 대표되는 단백질에 대한 항체와 함께 incubated입니다. 첫 번째 차원 높은 분자 질량으로이 단백질을 포함하는 모든 MPCs의 변화이 발생합니다. 이러한 MPCs의 일부 다른 단백질이 복잡한 특정 변화를 받아야하므로 두 번째 차원 SDS - 겔에서 식별하는 쉬운 것입니다.

뿐만 아니라 MPCs의 구성은 BN - PAGE로 분석뿐만 아니라 자신의 stoichiometry의 결정은 (Schamel 및 Reth 2000) 수도 수 있으며 (Schamel 2001), (스와미, Minguet 외 2007.). 이를 위해 NAMOS 분석 (기본 항체 기반 이동성 교대 분석)을 수행할 수 있습니다. 항체 기반 겔 변화 분석에서와 마찬가지로, 세포 lysates은 단클론 subunit 특정 항체와 incubated 있습니다. 이것은 MPCs의 stoichiometry에있는 변화의 범위에서 추론을 허용 BN - 젤에서 전기 immunoshifts의 유도에 연결

conlusion에서 BN - PAGE은 MPCs의 식별과 크기, 구성뿐만 아니라, 상대 풍요의 결정에 적합합니다. NAMOS 분석으로 수행, 그것은 또한 특정 MPC의 stoichiometry을 결정할 수있는 가능성을 제공합니다. 의 일반적인 적용을 감안할 때,이 기법은 MPCs의 특성 (. 데커, 뮐러 1996)에 대한 매우 유용한 도구입니다, (위티그 및 Schagger 2008), (바그너, Rehling 외 2009)., (위티그 및 Schägger 2009) .

Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

우리는 마이클 Reth, 헤르만 Schägger와 마가리타 과학 지원 카마초 - Carvajal 감사합니다. 이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft (DFG)에서 BIOSS하여 Bundesministerium fuer Bildung 및 Forschung (BMBF)에서 FO​​RSYS에 의해 재정 지원하고, 독일 연방 및 주 정부의 우수 이니셔티브 (GSC - 4, Spemann 대학원에서 일부 지원이 ).

References

  1. Arnold, I., Pfeiffer, K. Yeast mitochondrial F1F0-ATP synthase exists as a dimer: identification of three dimer-specific subunits. EMBO J. 17, (24), 7170-7178 (1998).
  2. Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B. Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach. Mol. Cell. Proteomics. 3, (2), 176-182 (2004).
  3. Heiss, K., Junkes, C. Subproteomic analysis of metal-interacting proteins in human B cells. Proteomics. 5, (14), 3614-3622 (2005).
  4. Sali, A., Glaeser, R. From words to literature in structural proteomics. Nature. 422, 216-225 (2003).
  5. Schägger, H., Cramer, W. A. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal. Biochem. 217, (2), 220-230 (1994).
  6. Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Anal. Biochem. 199, (2), 223-231 (1991).
  7. Schamel, W. W. Biotinylation of protein complexes may lead to aggregation as well as to loss of subunits as revealed by Blue Native PAGE. J Immunol Methods. 252, (1-2), 171-174 (2001).
  8. Schamel, W. W., Arechaga, I. Coexistence of multivalent and monovalent TCRs explains high sensitivity and wide range of response. J. Exp. Med. 202, 493-503 (2005).
  9. Schamel, W. W., Reth, M. Monomeric and oligomeric complexes of the B cell antigen receptor. Immunity. 13, (1), 5-14 (2000).
  10. Swamy, M., Minguet, S. A native antibody-based mobility-shift technique (NAMOS-assay) to determine the stoichiometry of multiprotein complexes. J Immunol Methods. 324, (1-2), 74-83 (2007).
  11. Swamy, M., Siegers, G. M. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for the identification and analysis of multiprotein complexes. Sci STKE. 2006, (345), 4-4 (2006).
  12. Wittig, I., Schagger, H. Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis. Proteomics. 8, 3974-3990 (2008).

Comments

12 Comments

  1. Dear All,

    I found this article quite interesting and useful. Thanks for the providing the information in such a wonderful way.

    Regards,
    GAnesh

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 5, 2011 - 5:12 PM
  2. Why can not I see the video...? please help me..

    Regards,
    Jalal

    Reply
    Posted by: JALAL A.
    July 10, 2011 - 1:39 AM
  3. Please email us at support@jove.com and we will be glad to help you out. Please make sure that you have the latest version of Flash installed.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 10, 2011 - 12:03 PM
  4. Hi Britta, you guys did a wonderful job in explaining something rather elaborate. Hiowever, I would like to ask some questions:
    1. the 30 ml gel referred in the Swamy, M.,et al ²006 paper is the large or small gel? Which by the way is another good and clear paper way better than that protocol from Nature protocols Wittig et al, ²006.
    ². Yesterday I poured a 30 ml gel and got the samples in at 100 volts (with 0.01 A) howerver it only run a third of the gel and current went down to 0.00 and it stopped there (gel: 11 cm x 16 cm x 1.5 mm). Why is this and how can I fix it? Rosa Bermudez from Molecular Biology Department (MeXICO).

    Reply
    Posted by: Rosa B.
    October 5, 2011 - 6:26 PM
  5. I think the buffer of upper chamber was leaked down into the down chamber, hence the current was stopped. You can fix it by using a pomade. Also you can pour the extra buffer in upper chamber by using a syringe.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 6, 2011 - 4:40 AM
  6. Your service is awesome! thank you very much, i really apreaciate this!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 3, 2012 - 10:27 AM
  7. I have ² very VERY important comments that literally 5 minutes ago ruined my extracted samples. I think the video/paper needs to more STRONGLY point to them:
    1. DRY DRY DRY DRY the wells VERY VERY VERY well!!! If you have even the tiniest amount of liquid the sample will LEAK into the next well AND THE NEXT!!! Basically initially i had semi-dry well and from Well 1 leaked up to WELL 4. everything was contaminated. THEN I got a new gel and dried them with an aspirator SUPER WELL....guess what in 3 minutes well 1 was already slowly creeping into well ² and 3. SOOOOO I would suggest to follow the FILL-WELLS-WITH-CATHODE Buffer (no coomassie version)-METHOD. Otherwise it will leak everywhere. I have no idea how this did not happen in this video or they simply brushed over it soooo quickly and u cannot see it.
    ². Secondly, when you put the Cathode buffer everything is VERY BLUE!!!! I have no idea how are they able to say "when the samples have entered the gel". this is very hard to see. maybe their room is very well lit with but my cold room is not that great and everything looks dark blue and nothing I can see. U have to keep this in mind to maybe bring a light.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 23, 2012 - 6:21 PM
  8. Dear K
    thanks for your interest in our protocol and your comments.
    Regarding your comments:
    1. Loading your samples dry into empty wells should not cause them to leak into neighbouring wells. This might only happen in case your wells were filled with liquid (as the BN buffer, in contrast to SDS sample buffer, dŒs not cause the sample to sink into the well). As shown in the video in our lab we remove the comb and load directly into the empty lanes without washing them or anything. I suggest you to check whether the wells themselves are fine after removing the comb. Additionally you should make sure to fill same volumes into every single well, use BN-lysis buffer for wells without sample.
    ². It is true that everything seems to be very blue after addition of blue cathode buffer into the inner chamber. Still, with some practice you will be able to identifiy the running front of your gel without any problems. Focus on the left and right side of the gel, where the glass plate of the gel is pressed onto the rubber of the running chamber. There you can easily see the staight line of the running front as the background is of the coulour of the rubber and not blue due to the buffer. You could also carefully remove the blue cathode buffer from the inner chamber using a pipette.
    Good luck for your next Blue Native!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 24, 2012 - 8:47 AM
  9. Thank you for the great reply. It is true that a blue front can be seen but veeeeeeeery slightly. Also eventually there are ² fronts. FIRST: between the transparent gel and the dark blue and SECONDLY: between the dark blue and the lighter blue buffer. Many papers say "stop eletrophoresis when the front reaches the bottom" I guess I assume this to be when the gel is completely BLUE. So I should ignore the second front?

    In addition, I am very curious about performing a Western directly after the Blue NATIVE. The procedure described here is after the ²D SDS which is different I think. I tried to find protocol for Western immediately after BN-Native but nothing online seems too clear. There are several differenced that I am trying to figure out. For example: the PVDF is completely stained, so how exactly do I destain it (I dont want to use too much acid etc.). Also, somewhere I read that NO BSA blocking step is necessary when doing BN-Native + PVDF membrane. Those are just a few questions that I have.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 31, 2012 - 3:32 PM
  10. For performing Western directly after 1st dimension BN-PAGE I recommend you to use the semidry system and normal transfer buffer. Of course your gel will be blue, but depending on what you do afterwards that is not a problem (e.g. immunodetection). To have a lighter blue gel you could also exchange blue cathode buffer with colorless cathode buffer during gel run as soon as your samples entered the separating gel.
    Blocking is still necessary! After transfer the membrane should be handeled normally. Please see also Swamy et al. ²006.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 1, 2012 - 3:31 AM
  11. Actually, you don't need to be worried about when to stop the run. According to the original paper [please find Anal. Biochem. ²17(²), ²²0-²30 (1994)], the pore-size distribution determines the individual migration ends of proteins. You could just run until the current stop (your power supply may show an error signal). Everything that could be separated in your gel will be stay at their own sites.

    Reply
    Posted by: Yeh-Lin L.
    February 3, 2012 - 2:58 AM
  12. Thank you so much for your replies. I still have some strange results.
    1. I noticed that in the Swamy et al ²006 paper you suggested to me and also the video here, your samples are TRANSPARENT, however the original Wittig and other papers have their sample with Coomassie Blue prior to loading. resulting in very very blue samples. I do not know if this is an issue.
    ². However when I run the sample they definitely remain as very very thick blue spots on my gel.
    3. Also, I run gel 1h then increase to 150-170V for another ²+ hours, the dark blue front reaches the bottom SORT OF (look at image), the thick BLUE spots are very visible, and also the upper half of the gel is lighter because of the second lighter cathode buffer. But I never get such a CLEAR and perfect line like yours. My DARK blue part of the gel remains there and as you see underneath the big blue spots there is nothing.
    PLEASE look at the image: http://tinypic.com/view.php?pic=110kcxh&s=5 (look at lanes 3-4-5)

    I am just confused, do I have too much sample. Why do I have such enormous blue spots very clearly visible. My proteins are transmembrane proteins that are very very highly over-expressed. Maybe I should load less? They should be sizes 60kDa, 90kDa at 150kDa. I am using the Bio-rad pre-casted Tris-HCl gels 4-15%.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 6, 2012 - 10:19 PM

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