ब्लू multiprotein परिसर के सेलुलर lysates से विश्लेषण के लिए मूल polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (बी एन पृष्ठ)

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Summary

इस वीडियो में, हम नीले देशी polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (बी एन पृष्ठ) द्वारा multiprotein परिसरों (MPCs) के लक्षण वर्णन का वर्णन. पहली बार एक आयाम में, dialyzed सेलुलर lysates बीएन पृष्ठ के द्वारा अलग कर रहे हैं व्यक्तिगत MPCs की पहचान कर सकते हैं. एसडीएस पृष्ठ एक दूसरे आयाम में, ब्याज की MPCs आगे immunoblotting द्वारा उनके घटक विश्लेषण subdivided रहे हैं.

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Fiala, G. J., Schamel, W. W. A., Blumenthal, B. Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates. J. Vis. Exp. (48), e2164, doi:10.3791/2164 (2011).

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Abstract

Multiprotein परिसरों (MPCs) संकेतन सेल में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, के बाद से सबसे अधिक प्रोटीन अन्य प्रोटीन के साथ कार्यात्मक या नियामक परिसरों (साली, Glaeser एट अल 2003.) में पाया जा सकता है है. इस प्रकार, प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत नेटवर्क के अध्ययन MPCs का विस्तृत विशेषताओं की आवश्यकता है प्रोटीन समारोह और विनियमन के एक एकीकृत समझ पाने के लिए. पहचान और विश्लेषण के लिए, MPCs देशी शर्तों के तहत अलग किया जाना चाहिए. इस वीडियो में, हम नीले देशी polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (बी एन पृष्ठ) द्वारा MPCs के विश्लेषण का वर्णन. बीएन पृष्ठ एक तकनीक है कि एक उच्च संकल्प की तुलना में जेल निस्पंदन या sucrose के घनत्व ultracentrifugation द्वारा की पेशकश की के साथ एक देशी रचना में MPCs की जुदाई की अनुमति देता है, और इसलिए उपयोगी है MPC आकार, संरचना, और रिश्तेदार बहुतायत (Schägger और वॉन Jagow 1991) निर्धारित है (Schägger, Cramer एट अल 1994.). इस विधि से, प्रोटीन उनके hydrodynamic आकार और एक polyacrylamide मैट्रिक्स में आकार के अनुसार अलग कर रहे हैं. यहाँ, हम कुल सेलुलर lysates के MPCs के विश्लेषण का प्रदर्शन, बाहर इशारा करते हुए कि lysate डायलिसिस बीएन पृष्ठ इन जैविक नमूनों को लागू करना महत्वपूर्ण कदम है. पहली आयाम बीएन और दूसरा आयाम एसडीएस पृष्ठ का एक संयोजन का उपयोग करना, हम बताते हैं कि बीएन पृष्ठ से अलग MPCs एसडीएस पृष्ठ से आगे जा सकता है अपनी व्यक्तिगत घटकों में subdivided. जेल जुदाई पर MPC घटकों के विज़ुअलाइज़ेशन मानक immunoblotting द्वारा किया जाता है. बीएन पृष्ठ द्वारा MPC विश्लेषण के लिए एक उदाहरण के रूप में, हम अच्छी तरह से विशेषता यूकेरियोटिक 19S, 20S, और 26S proteasomes चुना.

Protocol

ब्लू multiprotein परिसर की पहचान और विश्लेषण के लिए मूल polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (बी एन पृष्ठ): ** यह वीडियो एक जुड़े एक प्रकाशन प्रोटोकॉल पर आधारित है . महिमा स्वामी, गेबरियल एम. SIEGERS, सुज़ाना Minguet, Bernd Wollscheid, और वोल्फगैंग WA Schamel. विज्ञान 2006 STKE (345): pl2, 25 जुलाई, 2006, [DOI: 10.1126/stke.3892006pl4] कृपया यहाँ क्लिक करें इस प्रकाशन देखने के लिए .

1. Dialyzed सेल lysate की तैयारी

  1. हार्वेस्ट 10x10 कोशिकाओं 6 और centrifugation द्वारा गोली 350g पर 4 में 5 मिनट के लिए डिग्री सेल्सियस
  2. ठंडा पीबीएस (1 नुस्खा) के 1 एमएल के साथ सेल गोली तीन बार धो, 1.1 चरण में अपकेंद्रित्र.
  3. बहुत ठंडा बीएन - lysis बफर (2 नुस्खा) के 250 μL में Resuspend गोली और 15 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं.
  4. 13,000 जी में 4 बजे 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस अघुलनशील सामग्री हटाने के लिए.
  5. एक 1.5 एमएल microcentrifuge पाश्चर विंदुक के गर्म बड़े व्यास की ओर का उपयोग ट्यूब की टोपी में एक छेद पिगलो, तो बर्फ पर ट्यूब जगह डिग्री सेल्सियस 4 शांत
  6. टोपी में छेद के साथ ठंडा ट्यूब में 1.4 कदम से स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला.
  7. खोला ट्यूब के ऊपर, बंद टोपी पर संदंश के साथ एक डायलिसिस झिल्ली (10 केडी की आणविक भार कट ऑफ) प्लेस, और अधिक डायलिसिस झिल्ली है कि बाहर चिपक जाती है कटौती.
  8. Parafilm साथ सावधानी तरफ टोपी सील.
  9. ट्यूबों उलटें और एक सेल संस्कृति अपकेंद्रित्र में एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में सबसे कम संभव गति पर ऊपर से नीचे 4 में 10 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस चिमटी का उपयोग करने के लिए ट्यूब दाईं ओर मोड़ से बचने अपकेंद्रित्र से उल्टे ट्यूब निकालें.
  10. ठंड बीएन डायलिसिस (3 नुस्खा) बफर और हलचल की थाली के साथ एक 100 एमएल बीकर तैयार. 100 μL नमूना प्रति बफर बीएन - डायलिसिस के कम से कम 10 एमएल का उपयोग करें.
  11. प्रत्यय बीकर अंदर टेप उल्टा के साथ, ट्यूब और छेद से एक तुला पाश्चर पिपेट का उपयोग टोपी के नीचे हवाई बुलबुले को दूर.
  12. एक चुंबक दोषी के शीर्ष पर प्लेस बीकर, दोषी पर स्विच और यह 6 घंटे या ठंडे कमरे में रात भर के लिए छोड़ दें. कभी कभी की जाँच करें सुनिश्चित करें कि भावप्रवण हवा बुलबुले डायलिसिस झिल्ली पर नहीं पैदा कर रही है.
  13. एक नए ठंडा microcentrifuge ट्यूब में dialyzed सेल lysate लीजिए.

2. के गिरने बीएन - जैल

  1. ढाल डालने के लिये जेल कमरे के तापमान पर एक ढाल मिक्सर के साथ किया जाता है. दस्ताने क्योंकि polyacrylamide अत्यधिक neurotoxic है पहना होना चाहिए. एसडीएस के साथ किसी भी संपर्क से बचें.
  2. ढाल मिक्सर हलचल थाली पर प्लेस और लचीला टयूबिंग की एक टुकड़ा करने के लिए देते हैं. वाल्व का उपयोग चैनल बंद करो और एक घोड़े का अंसबंध के साथ टयूबिंग बंद. एक चुंबकीय उत्तेजक "उच्च" टयूबिंग के लिए जुड़ा हुआ सिलेंडर में 15% रखें.
  3. थ्रेड peristalitic पंप में लचीला टयूबिंग और अपने अंत के लिए एक सिरिंज सुई देते हैं. फिर, जेल तंत्र के दो गिलास प्लेट के बीच सुई जगह है.
  4. 4% (नुस्खा 5) और 15% (नुस्खा 6) जेल समाधान को अलग करने, ए पी एस जोड़ने और उपयोग करने से पहले तुरंत TEMED तैयार. संयुक्त मात्रा अलग जेल की मात्रा के बराबर होना चाहिए.
  5. ढाल मिक्सर की इसी सिलेंडरों ("कम" में 4% और "उच्च" सिलेंडर में 15%) में इन जेल समाधान डालो.
  6. वाल्व और अपने अंगूठे के साथ छोड़ दिया सिलेंडर पर दबाकर दो जेल जलाशयों को जोड़ने चैनल के अंदर हवा बुलबुला बाहर बल खोलें.
  7. चुंबकीय उत्तेजक पर स्विच करने के लिए, क्लैंप हटाने, और peristalitic पंप पर प्रति मिनट 5 मिलीलीटर के लिए स्विच. जेल धीरे से गिलास प्लेट के बीच प्रवाह के लिए अनुमति दें. सुनिश्चित करें कि सुई हमेशा तरल ऊपर है.
  8. सभी तरल जेल तंत्र में प्रवेश करने की अनुमति दें, और फिर isopropanol साथ धीरे उपरिशायी. जेल कमरे के तापमान पर कम से कम 30 मिनट के लिए polymerize करने की अनुमति दें.
  9. DH 2 हे (डिटर्जेंट का प्रयोग नहीं) के साथ गिरने तुरंत तंत्र साफ़ .
  10. Isopropanol निकालें, DH 2 हे के साथ धोने, और एक वाटमान कागज के साथ DH 2 हे हटायें .
  11. एक 3.2% stacking जेल (7 नुस्खा) तैयार करें, ए पी एस जोड़ने और उपयोग करने से पहले तुरंत TEMED.
  12. अलग जेल के शीर्ष पर stacking जेल डालो और गिलास प्लेटों के बीच कंघी परिचय, बुलबुले से परहेज. बाद stacking जेल polymerized है, जेल शांत करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस
  13. तुरंत नमूना लोड हो रहा से पहले, कंघी धीरे धीरे निकालने के लिए, यह जेल के विमान को एक कोण पर बाहर खींच. यह हवा तेजी से जेब, जो कुओं की गुणवत्ता में सुधार दर्ज की अनुमति देता है.

3. Dialyzed सेल lysate के बी.एन. पृष्ठ द्वारा पृथक्करण

  1. सूखे कुओं में 4 dialyzed lysate के 1 से 40 μL और मार्कर मिक्स के 10 से 20 μl (10 नुस्खा) लोड डिग्री सेल्सियस ठंड कैथोड बफर (नुस्खा 8) के साथ प्रत्येक कुएं में नमूने ओवरले.
  2. ठंड बिल्ली के साथ भीतरी कक्ष भरेंhode बफर और ठंड Anode बफर के साथ / बाहरी निचले सदन (9 नुस्खा).
  3. एक minigel या एक बड़ी जेल के लिए 150V 100 वी लागू करने के लिए, जब तक नमूने अलग जेल में प्रवेश किया है. 4 में जेल भागो डिग्री सेल्सियस
  4. 180 (minigel) वी या 400 वी (बड़े जेल) वोल्टेज बढ़ाने के लिए और चलाने डाई सामने तक जेल के अंत तक पहुँचता है. चलाने के लिए 3 से 4 घंटे लगते मिनी, और एक बड़ी जेल के लिए 18 से 24 घंटे.

4. दूसरा आयाम एसडीएस पृष्ठ

  1. पहली आयाम बीएन पृष्ठ लेन, एक वजन आणविक मार्कर के लिए नियमित रूप से लेन dialyzed lysate है कि विभाज्य के लिए और एक नियमित रूप से लेन के लिए एक ही बड़ा लेन के साथ एक मानक 10% एसडीएस जेल (15/12 व्यंजनों) तैयार एसडीएस नमूना बफर (नुस्खा 11) के साथ मिश्रित किया गया है और 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए उबला हुआ Spacers जिनकी मोटाई स्कॉच टेप के दो परतों की वृद्धि हुई किया गया था बीएन पृष्ठ पर जेल टुकड़ा एसडीएस जेल की लोडिंग को सरल का उपयोग करें.
  2. जेल वैद्युतकणसंचलन तंत्र से प्लेटों में बीएन पृष्ठ निकालें और धीरे से ऊपर एक थाली जिज्ञासा.
  3. Stacking जेल निकालें और बीएन पृष्ठ ब्याज की प्रोटीन युक्त जेल के बाहर कटौती लेन.
  4. बीएन पृष्ठ 2x एसडीएस नमूना बफर और सेते में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए जेल टुकड़ा रखें.
  5. एक माइक्रोवेव में जेल बीएन पृष्ठ टुकड़ा संक्षिप्त (नहीं अधिक से अधिक 20 सेकंड) को उबाल लें.
  6. बीएन पृष्ठ कमरे के तापमान पर एक और 15 मिनट के लिए गर्म एसडीएस नमूना बफर में जेल टुकड़ा सेते हैं.
  7. एसडीएस - PAGE जेल से परहेज हवा बुलबुले, और एसडीएस नमूना बफर के साथ टुकड़ा उपरिशायी के stacking जेल में अच्छी तरह से बड़े पर जेल बीएन PAGE टुकड़ा लोड. मार्कर और lysate नियंत्रण लोड.
  8. मानक प्रोटोकॉल के अनुसार वैद्युतकणसंचलन प्रदर्शन.

5. MPC सब यूनिटों के immunoblotting द्वारा पता लगाने

  1. हस्तांतरण के लिए, छह वाटमान कागजात और एक PVDF झिल्ली एसडीएस जेल के आकार के लिए फिटिंग तैयार.
  2. 30 एस के लिए 100% मेथनॉल में PVDF झिल्ली सेते और हस्तांतरण बफर (16 नुस्खा) में वाटमान कागजात लेना.
  3. जगह तीन वाटमान कागजात, PVDF झिल्ली, एसडीएस जेल (जेल stacking हटायें), और फिर से एक semidry हस्तांतरण कक्ष में एक सैंडविच की तरह संरचना में तीन वाटमान कागजात.
  4. 25 मिनट के लिए 20 वी लागू करें.
  5. मानक immunoblotting प्रोटोकॉल के अनुसार प्रोटीन का पता लगाने.

6. प्रतिनिधि परिणाम

हम MPC लक्षण वर्णन के लिए यूकेरियोटिक 19S, 20S, और एक उदाहरण के रूप में 26S proteasomes की 2D बीएन / एसडीएस PAGE (चित्रा 1 ए) के द्वारा विश्लेषण प्रस्तुत करते हैं. एक बफर के साथ 0.1% युक्त HEK293 कोशिकाओं lysed थे ट्राइटन डिटर्जेंट के रूप में झिल्ली बाधित और झिल्ली प्रोटीन परिसरों solubilize X-100. ये lysates बीएन - डायलिसिस बफर के खिलाफ dialyzed लवण और छोटे चयापचयों निकालने थे. फिर, MPCs 4-15% ढाल एक दूसरे आयाम एसडीएस पृष्ठ से बाद बीएन पृष्ठ से अलग हो गए थे. प्रोटीन β2 और एंटीबॉडी 20S के Mcp21 सब यूनिटों के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ immunoblotting द्वारा visualized थे.

चित्रा 1
चित्रा 1. एक दो आयामी BN-PAGE/SDS-PAGE सेलुलर lysates का उपयोग (ए) सेलुलर lysates से एक 2d BN-PAGE/SDS-PAGE दृष्टिकोण के प्रवाह आरेख दृष्टिकोण. . (बी) एक 2d BN-PAGE/SDS-PAGE की योजनाबद्ध योजना. एक प्रथम आयाम में प्रोटीन और MPCs देशी शर्तों के तहत बीएन पृष्ठ द्वारा अलग कर रहे हैं. दूसरा आयाम के लिए, प्रोटीन और या MPCs / जेल पट्टी में एसडीएस द्वारा विकृत बीएन पृष्ठ द्वारा जुदाई के बाद कर रहे हैं और बाद में एसडीएस पृष्ठ के अधीन है. Monomeric प्रोटीन एक अतिशयोक्तिपूर्ण पहली बार में ढाल जेल और दूसरे आयाम में एक रेखीय जेल विकर्ण कारण विस्थापित होगा. एक ठोस एमपीसी के घटक विकर्ण, एक खड़ी रेखा पर स्थित नीचे मिल जाएगा.

यह दिखाया गया है कि पहली आयाम बीएन और दूसरा आयाम एसडीएस PAGE के संयोजन के द्वारा, monomeric प्रोटीन पहला और दूसरा (आयाम में रैखिक जेल में एक अतिशयोक्तिपूर्ण ढाल जेल के कारण विकर्ण के भीतर विस्थापित (केमाको Carvajal, Wollscheid एट अल 2004), चित्रा 1 बी). MPCs के घटक इस विकर्ण नीचे स्थित हैं. प्रोटीन है कि एक ही एमपीसी के सब यूनिटों का प्रतिनिधित्व करते हैं एक दूसरे आयाम में खड़ी रेखा में पाया जा सकता है, जबकि एक क्षैतिज पंक्ति में एक ही प्रोटीन के कई स्थानों में कई अलग MPCs में प्रोटीन की उपस्थिति से संकेत मिलता है. चित्रा 2 से पता चलता है कि हमारे प्रयोग में β2 और Mcp21 के खिलाफ immunoblotting विशिष्ट प्रोटीन इन proteasomal सब यूनिटों वाले परिसरों की उपस्थिति का पता चला. दोनों प्रोटीन एक क्षैतिज रेखा में अलग - अलग व्यवस्था धब्बे के रूप में detectable थे, यह दर्शाता है कि β2 और Mcp21 कई विशिष्ट MPCs के घटक का प्रतिनिधित्व. ये MPCs 26S (20S प्लस 19S टोपी) एंटीबॉडी, नियामक सबयूनिट PA28 के साथ एक साथ एंटीबॉडी 20S के रूप में स्पष्ट रूप से पहचाना जा सकता है, और 20S अकेले उनके आकार और संरचना के आधार पर, proteasomes. साथ में ले ली, इन resuलीटर का प्रदर्शन है कि अंतर्जात MPCs और पहचान जा सकता है एक दो आयामी BN-PAGE/SDS-PAGE दृष्टिकोण सेलुलर lysate का उपयोग द्वारा विशेषता है. इस पद्धति का आकार, संरचना, और MPCs के रिश्तेदार बहुतायत के निर्धारण के लिए लागू है.

चित्रा 2
चित्रा 2. दो आयामी BN-PAGE/SDS-PAGE के बाद immunoblotting द्वारा यूकेरियोटिक यूकेरियोटिक proteasomes की पहचान और विश्लेषण के लिए एंटीबॉडी. अलग अलग रूपों की जांच, HEK293 कोशिकाओं के साथ 0.1% Triton एक्स 100 lysed थे. सेलुलर lysates dialyzed थे और बाद में बीएन पन्ना (4-15%) के लिए अलग MPCs के अधीन है. बाद में, एक दूसरे आयाम एसडीएस पृष्ठ (10%) व्यक्तिगत subcomponents के आकार की जुदाई के लिए चलाया गया था. Immunoblotting विशिष्ट Mcp21 और 20S मुख्य परिसर के β2 सबयूनिट, और नियामक सबयूनिट PA28 पहचानने एंटीबॉडी के साथ प्रदर्शन किया था.

विशिष्ट अभिकर्मकों मैं टेबल (वर्णानुक्रम):

अभिकर्मक कंपनी टिप्पणियाँ
6 aminohexanoic एसिड
(Ε - aminocaproic एसिड)
सिग्मा Aldrich, Taufkirchen, जर्मनी यह रासायनिक एक अड़चन है और दस्ताने के साथ संभाला होना चाहिए.
Acrylamide-bisacrylamide समाधान (40%), मिक्स 32:1 Applichem, Darmstadt, जर्मनी यह समाधान neurotoxic है और दस्ताने के साथ संभाला होना चाहिए.
बीआईएस - tris Roth, कार्लज़ूए, Germa-ny
96 बृज सिग्मा Aldrich, Taufkirchen, जर्मनी
Coomassie नीले G250 Serva, हीडलबर्ग, Ger कई Coomassie नीले R250 या कोलाइडयन सीओओ मैसी ब्लूज़ जैसे Coomassie डाई के अन्य प्रकार के विकल्प नहीं है.
Digitonin सिग्मा Aldrich, Taufkirchen, जर्मनी Digitonin विषाक्त है. दस्ताने जब इस रोकते सज्जन युक्त बफ़र्स या नमूने से निपटने पहना होना चाहिए.
Dodecylmaltoside Applichem, Darmstadt, जर्मनी
Triton एक्स - 100 Roth, कार्लज़ूए, Germa-ny Triton एक्स 100 विषैला होता है. दस्ताने जब बफ़र्स या इस डिटर्जेंट युक्त नमूने से निपटने पहना होना चाहिए.

द्वितीय. विशिष्ट सामग्री और उपकरणों की तालिका:

उपकरण कंपनी
डायलिसिस झिल्ली (कट ऑफ आणविक वजन 10 से 50 केडी) Roth, कार्लज़ूए, जर्मनी
जेल वैद्युतकणसंचलन प्रणाली जैव रेड, म्यूनिख, जर्मनी से उदाहरण के लिए
ग्रेडियेंट मिक्सर स्व - निर्मित या वाणिज्यिक जैव रेड, म्यूनिख, जर्मनी से उपलब्ध
क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप Amersham Pharmacia बायोटेक, Freiburg, जर्मनी
Polyvinylidene difluoride झिल्ली (PVDF) Immobilon पी, Millipore, Eschborn, जर्मनी
अर्ध शुष्क हस्तांतरण उपकरण जैव रेड, म्यूनिख, जर्मनी से उदाहरण के लिए
सिलिकॉन टयूबिंग (3 से 5 मिमी व्यास, 1 मीटर लंबाई) NeoLab, हीडलबर्ग, जर्मनी

III. व्यंजनों की तालिका:

नहीं. Buffers और समाधान सामग्री टिप्पणियाँ
1 फास्फेट-buffered खारा (पीबीएस) ना 2 8.1 4 HPO 2 mMKH
पीओ 4 1.5 मिमी
138 मिमी NaCl
2.7 मिमी KCl
समाधान 7.4 पीएच हो अगर ठीक पूर्व - मुकाबले चाहिए.
2 बी एन - lysis बफर बेस बफर
बीआईएस - tris 20 मिमी
ε - aminocaproic एसिड 500 मिमी
20 मिमी NaCl
EDTA, पीएच 8.0 2 मिमी
10% ग्लिसरॉल

एचसीएल के साथ 7.0 करने के लिए पीएच को समायोजित करें. 4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस

डिटर्जेंट
0.5 से 1.0% Digitonin
या बृज 96 0.1 से 0.5%
या ट्राइटन 0,1 करने के लिए 0.5%-100 एक्स
या 0.1 से 0.5% Dodecylmaltoside

Protease और फॉस्फेट inhibitors
Aprotinin μg एमएल / 10
Leupeptin 10 μg एमएल /
1 मिमी PMSF
सोडियम फ्लोराइड 0.5 मिमी
सोडियम orthovanadate 0.5 मिमी
उचित डिटर्जेंट empirically निर्धारित किया जाना चाहिए और अन्य lysis बफर व्यंजनों में इस्तेमाल किया है कि के रूप में ही किया जाना चाहिए.

Digitonin बस DH 2 हे (5 मिलीलीटर aliquots में -20 पर दुकान ° सी) में एक 2% शेयर समाधान से का उपयोग करने से पहले जोड़ा जाना चाहिए.

Protease और phophatase-रोकना अन्य रैंकों का उपयोग करने से पहले तुरंत जोड़ा जाना चाहिए.

Orthova - nadate सोडियम के अलावा पर, बफर में पीले रंग का हो जाएगा.
3 बी एन - डायलिसिस बफर बेस बफर
बीआईएस - tris 20 मिमी
ε - aminocaproic एसिड 500 मिमी
20 मिमी NaCl
EDTA, पीएच 8.0 2 मिमी
10% ग्लिसरॉल

एचसीएल के साथ 7.0 करने के लिए पीएच को समायोजित करें. 4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस

डिटर्जेंट
0,3 करने के लिए 0,5% Digitonin
या ट्राइटन 0.1% - 100 एक्स
या बृज 96 0.1%
या Dodecylmaltoside 0.1%

Protease और फॉस्फेट inhibitors
1 मिमी PMSF
सोडियम orthovanadate 0.5 मिमी
डिटर्जेंट उपयुक्त empirically निर्धारित होना चाहिए और अन्य lysis buffers में इस्तेमाल किया है कि के रूप में ही किया जाना चाहिए, लेकिन कम - concentra माहौल संकेत दिया.

डिटर्जेंट जेल वैद्युतकणसंचलन के stacking कदम पर पूर्व वेंट एकत्रीकरण के लिए जोड़ा जाना चाहिए.

Protease और phophatase-रोकना अन्य रैंकों का उपयोग करने से पहले तुरंत जोड़ा जाना चाहिए.
4 3x बफर बीएन - जेल बीआईएस - tris 150 मिमी
ε - aminocaproic एसिड 200 मिमी

एचसीएल के साथ 7.0 करने के लिए पीएच को समायोजित करें. 4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस
5 4% जेल अलग 3x बीएन जेल (4 नुस्खा) बफर 5.00 एमएल
Acrylamide / Bisacrylamide 1.50 एमएल
DH दो हे 8.50 एमएल
ए पी एस, DH 2 हे 54 μL में 10%
TEMED 5.4 μL
Immedia - tely जेल गिरने से पहले ए पी एस और TEMED जोड़ें, के रूप में इन अभिकर्मकों polymerization को बढ़ावा देने.

यह नुस्खा एक 30 मिलीलीटर जेल कलाकारों के लिए पर्याप्त है. डाला जैल जा रहा है की संख्या और आकार के लिए मात्रा समायोजित करें.
6 15% जेल अलग 3x बीएन जेल (4 नुस्खा) बफर 5.00 एमएल
Acrylamide / Bisacrylamide 5.63 एमएल
70% 4.38 एमएल ग्लिसरॉल
ए पी एस, DH 2 हे 42 μL में 10%
TEMED 4.2 μL
Immedia - tely जेल गिरने से पहले ए पी एस और TEMED जोड़ें, के रूप में इन अभिकर्मकों polymerization को बढ़ावा देने.

यह नुस्खा एक 30 मिलीलीटर जेल कलाकारों के लिए पर्याप्त है. डाला जैल जा रहा है की संख्या और आकार के लिए मात्रा समायोजित करें.

acrylamide - bisacrylamide की एकाग्रता भी 10 से 18% से आवश्यक के रूप में विविध किया जा सकता है है.
7 3.2% जेल Stacking 3x बीएन जेल (4 नुस्खा) बफर 3.00 एमएल
Acrylamide / Bisacrylamide 0.72 एमएल
DH दो हे 5.28 एमएल
ए पी एस, DH 2 हे 120 μL में 10%
TEMED 12 μL
Immedia - tely जेल गिरने से पहले ए पी एस और TEMED जोड़ें, के रूप में इन अभिकर्मकों polymerization को बढ़ावा देने.

यह नुस्खा एक 30 मिलीलीटर जेल कलाकारों के लिए पर्याप्त है. डाला जैल जा रहा है की संख्या और आकार के लिए मात्रा समायोजित करें.
8 कैथोड बफर बीआईएस - tris 15 मिमी
50 मिमी Tricine
Coomassie नीले 0.02% G250

एक 10x शेयर के रूप में 1 लीटर तैयार, एचसीएल के साथ 7.0 पीएच, समायोजित और 4 बजे दुकान डिग्री सेल्सियस
DH 2 हे के साथ उपयोग करने से पहले 1:10 पतला .
Coomassie नीले R250 या कोलाइडयन Coomassie ब्लूज़ जैसे Coomassie डाई के अन्य प्रकार के विकल्प नहीं है.
9 Anode बफर 50 मिमी बीआईएस - tris

एक 10x शेयर के रूप में 1 लीटर तैयार, एचसीएल के साथ 7.0 पीएच, समायोजित और 4 बजे दुकान डिग्री सेल्सियस
DH 2 हे के साथ उपयोग करने से पहले 1:10 पतला .
10 मार्कर मिक्स Aldolase (158 केडी) 10 मिलीग्राम / एमएल
Catalase (232 केडी) 10 मिलीग्राम / एमएल
Ferritin (440 और 880 KD) 10 मिलीग्राम / एमएल
Thyroglobulin (670 केडी) 10 मिलीग्राम / एमएल
BSA (66 और 132 KD) 10 मिलीग्राम / एमएल
बीआईएस - tris 20 मिमी
20 मिमी NaCl
10% ग्लिसरॉल

एचसीएल के साथ 7.0 करने के लिए पीएच को समायोजित करें. 4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस
आण्विक वजन मार्करों भी Invitro पीढ़ी या Pharmacia सहित कई स्रोतों से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं.
11 एसडीएस नमूना बफर 12.5 मिमी Tris
4% एसडीएस
20% ग्लिसरॉल
Bromophenol 0.02% नीले

6.8 पीएच को समायोजित करें. डाइसल्फ़ाइड बांड को कम करने के लिए, 9 एमएल β-mercaptoethanol जोड़ें.
एसडीएस एक पाउडर और β पूर्व - captoethanol के रूप में विषाक्त कर रहे हैं. इसलिए, दस्ताने का उपयोग करें और एक डाकू के तहत काम करते हैं.
12 4x कम बफर Tris 1.5 मीटर
एसडीएस 0.4%

8.8 पीएच को समायोजित करें.
एक पाउडर के रूप में एसडीएस विषैला होता है. इसलिए, दस्ताने का उपयोग करें और एक डाकू के तहत काम करते हैं.
13 4x ऊपरी बफर Tris 0.5 मीटर
एसडीएस 0.4%

6.8 पीएच को समायोजित करें.
एक पाउडर के रूप में एसडीएस विषैला होता है. इसलिए, दस्ताने का उपयोग करें और एक डाकू के तहत काम करते हैं.
14 10% जेल अलग Acrylamide 2.0 (30%) एमएल
4x कम बफर 1.5 एमएल
DH दो हे 2.454 एमएल
ए पी एस, DH 2 हे 40 μL में 10%
TEMED 6 μL
Immedia - tely जेल गिरने से पहले ए पी एस और TEMED जोड़ें, के रूप में इन अभिकर्मकों polymerization को बढ़ावा देने.

यह नुस्खा एक 30 मिलीलीटर जेल कलाकारों के लिए पर्याप्त है. डाला जैल जा रहा है की संख्या और आकार के लिए मात्रा समायोजित करें.
15 4.8% जेल Stacking Acylamide (30%) 320 μL
4x ऊपरी बफर μL 500
DH दो हे 1.16 एमएल
ए पी एस, DH 2 हे में 10% 20 μL
TEMED 2 μL
Immedia - tely जेल गिरने से पहले ए पी एस और TEMED जोड़ें, के रूप में इन अभिकर्मकों polymerization को बढ़ावा देने.

यह नुस्खा एक 30 मिलीलीटर जेल कलाकारों के लिए पर्याप्त है. डाला जैल जा रहा है की संख्या और आकार के लिए मात्रा समायोजित करें.
16 Semidry स्थानांतरण बफर 48 मिमी Tris
Glycine 39 मिमी
20% मेथनॉल
एसडीएस 0.1%

1 लीटर DH 2 ओ के साथ मात्रा समायोजित कमरे के तापमान पर स्टोर.
एसडीएस एक पाउडर और मेथनॉल के रूप में विषाक्त कर रहे हैं. इसलिए, दस्ताने का उपयोग करें और एक डाकू के तहत काम करते हैं.

Discussion

इस अध्ययन में, हम बीएन पृष्ठ से MPCs के विश्लेषण का वर्णन. एक 2D दृष्टिकोण देशी शर्तों के तहत पहले अलग MPCs प्रयोग किया जाता है, और फिर आगे अपनी व्यक्तिगत घटकों में उन्हें एक दूसरे आयाम एसडीएस पृष्ठ से प्रतिभाग करना.

नमूने सेल lysates से तैयार हैं. कई MPCs के solubilization के लिए, एक उचित डिटर्जेंट की जरूरत है, जो प्रोटीन परिसरों की संरचना को बरकरार रखता है. यहाँ, हम 0.1% Triton एक्स 100 का उपयोग करें. हालांकि, इष्टतम डिटर्जेंट और उसके उपयुक्त एकाग्रता empirically हर एमपीसी के लिए निर्धारित किया है. के मामले में ट्राइटन X-100, उदाहरण के लिए, यह बताया गया है कि कम डिटर्जेंट सांद्रता एफ 1 के एक dimeric फार्म की पहचान करने की अनुमति F-0-ATPase जटिल (अर्नोल्ड, Pfeiffer एट अल 1998 .). हायर ट्राइटन - एक्स 100 सांद्रता, तथापि, डिमर का पृथक्करण और monomeric 1 एफ एफ 0 ATPase परिसर के एक इसी वृद्धि करने के लिए नेतृत्व. यह हमारे पूर्व अध्ययन के साथ लाइन में है, हम दिखाने थे कि multivalent टी सेल रिसेप्टर परिसर (TCR) जब बृज 96 की कम सांद्रता के साथ निकाली संरक्षित है, जबकि उच्च एकाग्रता या किसी अन्य डिटर्जेंट के उपयोग में digitonin परिणाम बुलाया monomeric TCR (Schamel, Arechaga एट अल 2005.) के निष्कर्षण. आमतौर पर इस्तेमाल किया डिटर्जेंट है कि परीक्षण किया जा सकता digitonin (0.5 से 1%), Triton एक्स 100 (0.1 से 0.5%), 96 बृज (0.1 से 0.5%), या dodecylmaltoside (0.1 से 0.5%) शामिल हैं. इन अभिकर्मकों nonionic डिटर्जेंट, जो MPC स्थिरता के लिए सबसे अच्छा हो जाते हैं. पता है कि एसडीएस और अन्य मजबूत डिटर्जेंट के साथ संपर्क (केमाको Carvajal, Wollscheid एट अल 2004.) से बचा जाना चाहिए.

Lysates के डायलिसिस MPC एक बीएन जेल में जुदाई (केमाको - Carvajal, Wollscheid एट अल 2004) को प्राप्त करने की आवश्यकता है, (Heiss, Junkes एट अल 2005 .). ऐसा लगता है कि नमक एकाग्रता या कम आणविक भार दोष को हटाने के समायोजन के उच्च संकल्प के लिए महत्वपूर्ण है. यह उल्लेखनीय है कि झिल्ली की तैयारियाँ और MPCs, जो immunopurified किया गया है और बाद में एंटीबॉडी से eluted बीएन पृष्ठ के लिए उपयुक्त हैं (स्वामी, SIEGERS एट अल 2006.) . दोनों ही मामलों में, नमूने के बीएन पृष्ठ जुदाई लिए dialyzed हो सकता है, अगर झिल्ली lysis या elution बीएन lysis बफर में किया जाता है नहीं है.

बीएन पृष्ठ द्वारा प्रोटीन जुदाई के लिए, डाई Coomassie नीले जरूरत है, जो प्रोटीन के लिए unspecifically बांध और उन्हें नकारात्मक आरोप के साथ शामिल है. इस प्रकार, Coomassie नीले तटस्थ पीएच (Schägger और वॉन Jagow 1991) पर कैथोड की ओर प्रोटीन के electrophoretic गतिशीलता सक्षम बनाता है, (Schägger, Cramer एट अल 1994.). इसके अलावा, Coomassie नीले वैद्युतकणसंचलन दौरान stacking जेल में प्रोटीन एकत्रीकरण रोकता है. बीएन पेज के लिए, Coomassie G250 Coomassie नीले R250 या कोलाइडयन Coomassie ब्लूज़ के बजाय इस्तेमाल किया जा है.

बीएन - जेल चलाने से पहले, यह सुनिश्चित करना आवश्यक है कि जेल का प्रतिशत ब्याज की MPC की उम्मीद आकार फिट बैठता है. अलग gradients और उपयुक्त बफ़र्स Invitrogen (NativePAGE Novex बीआईएस Tris जेल सिस्टम) से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं के साथ बी एन - जैल मिल में बना हुआ है. लेकिन बीएन जैल भी एक persistaltic पंप के साथ एक साथ एक ढाल मिश्रक का उपयोग कर तैयार किया जा सकता है. एक अक्षुण्ण ढाल की गारंटी करने के लिए, तरल डालने के लिये और बुलबुले से परहेज किया जाना चाहिए के दौरान लगातार प्रवाह चाहिए. हम जेल पर अलग नमूना dilutions की लोडिंग की सलाह देते हैं क्योंकि ओवरलोडिंग वैद्युतकणसंचलन प्रक्रिया के दौरान प्रोटीन की वर्षा के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसके अलावा, बी एन - जैल 4 में चलाने होना चाहिए ° सी प्रोटीन गिरावट को रोकने के लिए और MPCs को बरकरार रखने.

बाद बीएन पृष्ठ MPCs के दृश्य Coomassie शानदार नीले धुंधला हो जाना, चांदी धुंधला हो जाना या immunoblotting द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. प्रोटीन बैंड Coomassie या चांदी धुंधला द्वारा visualized मास स्पेक्ट्रोमेट्री (केमाको Carvajal, Wollscheid एट अल 2004.) द्वारा आगे के विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं. Immunoblotting के मामले में, ब्याज की MPCs के लिए इष्टतम हस्तांतरण शर्तों empirically निर्धारित किया है. पता है कि Coomassie नीले रंग भी एक बीएन जेल की सोख्ता के दौरान स्थानांतरित किया है. इसलिए, सफल स्थानांतरण के बाद जेल बेरंग हो, जबकि झिल्ली एक नीले रंग लागू होगा. इसके अलावा, यह महत्वपूर्ण है उल्लेख है कि नहीं हर प्राथमिक, एंटीबॉडी, जो एसडीएस पृष्ठ के बाद पता लगाने के लिए काम करता है बीएन पृष्ठ पर immunoblotting के लिए लागू है. यह हो सकता है कि एंटीबॉडी ब्याज की MPC पहचान नहीं है क्योंकि उनके मिलान प्रोटीन के देशी रचना में छिपा हुआ है. इस समस्या को दूर करने के लिए, यह संभव है कि शीघ्र ही जेल 1x एसडीएस नमूना बफर में उबलते द्वारा हस्तांतरण करने के लिए पहले बी एन - जेल के भीतर प्रोटीन denature.

हमारे उदाहरण में, हम प्रोटीन बैंड का पता लगाने के के लिए बीएन जेल सीधे अधीन नहीं था. इसके बजाय, हम आगे एक दूसरे dimensi द्वारा बी.एन. पृष्ठ अलग lysate विभाजितएसडीएस-पृष्ठ पर. दूसरा आयाम एसडीएस जेल में, monomeric प्रोटीन एक अतिशयोक्तिपूर्ण पहला और दूसरा आयाम (केमाको Carvajal, Wollscheid एट अल 2004.) में रैखिक जेल में ढाल जेल के कारण विकर्ण के भीतर विस्थापित . यह MPCs की आसान पहचान की अनुमति देता है, क्योंकि वे इस अतिपरवलयिक विकर्ण नीचे स्थानीयकृत हैं. एक अलग एमपीसी के subcomponents दूसरा आयाम एसडीएस पृष्ठ में एक ऊर्ध्वाधर पंक्ति में अलग हैं. अवयव है कि कई dinstinct MPCs के घटक हैं एमपीसी के आकार के अनुसार एक क्षैतिज रेखा पर पहचाना जा सकता है है. हालांकि, यह माना जा है कि कई प्रोटीन एक ऊर्ध्वाधर पंक्ति में प्रदर्शित होने धब्बे भी अलग परिसरों कि बीएन पृष्ठ में एक ही स्थान पर विस्थापित का हिस्सा हो सकता है. अंतिम सबूत है कि वे एक ही MPC में मौजूद हैं एक एंटीबॉडी आधारित जेल शिफ्ट परख द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. इस परख में, एक एंटीबॉडी के साथ सेलुलर lysate बी.एन. पृष्ठ करने के लिए पहले एक पहचान स्थलों में से एक द्वारा प्रतिनिधित्व प्रोटीन के खिलाफ incubated है. सभी MPCs है कि एक उच्च आणविक जन की ओर पहला आयाम में इस प्रोटीन होते हैं के एक पारी में यह परिणाम है. अन्य प्रोटीन भी है कि इन MPCs का एक हिस्सा हैं इस जटिल विशिष्ट बदलाव से गुजरना और इसलिए कर रहे हैं दूसरा आयाम एसडीएस जेल में पहचान के लिए आसान होगा.

न केवल MPCs की संरचना बीएन - PAGE द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है लेकिन उनके stoichiometry का निर्धारण संभव है (Schamel और Reth 2000); (2001 Schamel), (स्वामी, Minguet एट अल 2007.). इस प्रयोजन के लिए, एक NAMOS परख (देशी एंटीबॉडी आधारित परख गतिशीलता पारी) किया जा सकता है. एंटीबॉडी आधारित जेल शिफ्ट परख में के रूप में, सेलुलर lysates मोनोक्लोनल सबयूनिट विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ incubated हैं. यह बीएन जैल में electrophoretic immunoshifts की प्रेरण है जो बदलाव की हद तक से MPCs के stoichiometry पर निष्कर्ष अनुमति देते हैं होता है

Conlusion में, बीएन पृष्ठ MPCs की पहचान और उनके आकार, संरचना, के रूप में अच्छी तरह से रिश्तेदार बहुतायत के निर्धारण के लिए उपयुक्त है. एक NAMOS परख के रूप में प्रदर्शन किया, यह भी के लिए एक निश्चित एमपीसी के stoichiometry निर्धारित करने की संभावना प्रदान करता है. अपनी सामान्य प्रयोज्यता को देखते हुए, इस तकनीक MPCs (Dekker, मुलर एट अल 1996) के लक्षण वर्णन के लिए एक बहुत ही उपयोगी उपकरण है, (Wittig और Schagger 2008); (वैगनर, Rehling एट अल 2009.); (Wittig और Schägger 2009) .

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम माइकल Reth, हरमन Schägger, और वैज्ञानिक समर्थन के लिए केमाको - Carvajal Margarita धन्यवाद. इस काम से Bundesministerium fuer Bildung और Forschung (BMBF) FORSYS द्वारा वित्त पोषित किया गया था ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) से BIOSS द्वारा, और जर्मन संघीय और राज्य सरकारों की उत्कृष्टता पहल (GSC 4, Spemann ग्रेजुएट स्कूल द्वारा भाग में समर्थित ).

References

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  2. Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B. Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach. Mol. Cell. Proteomics. 3, (2), 176-182 (2004).
  3. Heiss, K., Junkes, C. Subproteomic analysis of metal-interacting proteins in human B cells. Proteomics. 5, (14), 3614-3622 (2005).
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  11. Swamy, M., Siegers, G. M. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for the identification and analysis of multiprotein complexes. Sci STKE. 2006, (345), 4-4 (2006).
  12. Wittig, I., Schagger, H. Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis. Proteomics. 8, 3974-3990 (2008).

Comments

12 Comments

  1. Dear All,

    I found this article quite interesting and useful. Thanks for the providing the information in such a wonderful way.

    Regards,
    GAnesh

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 5, 2011 - 5:12 PM
  2. Why can not I see the video...? please help me..

    Regards,
    Jalal

    Reply
    Posted by: JALAL A.
    July 10, 2011 - 1:39 AM
  3. Please email us at support@jove.com and we will be glad to help you out. Please make sure that you have the latest version of Flash installed.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 10, 2011 - 12:03 PM
  4. Hi Britta, you guys did a wonderful job in explaining something rather elaborate. Hiowever, I would like to ask some questions:
    1. the 30 ml gel referred in the Swamy, M.,et al ²006 paper is the large or small gel? Which by the way is another good and clear paper way better than that protocol from Nature protocols Wittig et al, ²006.
    ². Yesterday I poured a 30 ml gel and got the samples in at 100 volts (with 0.01 A) howerver it only run a third of the gel and current went down to 0.00 and it stopped there (gel: 11 cm x 16 cm x 1.5 mm). Why is this and how can I fix it? Rosa Bermudez from Molecular Biology Department (MeXICO).

    Reply
    Posted by: Rosa B.
    October 5, 2011 - 6:26 PM
  5. I think the buffer of upper chamber was leaked down into the down chamber, hence the current was stopped. You can fix it by using a pomade. Also you can pour the extra buffer in upper chamber by using a syringe.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 6, 2011 - 4:40 AM
  6. Your service is awesome! thank you very much, i really apreaciate this!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 3, 2012 - 10:27 AM
  7. I have ² very VERY important comments that literally 5 minutes ago ruined my extracted samples. I think the video/paper needs to more STRONGLY point to them:
    1. DRY DRY DRY DRY the wells VERY VERY VERY well!!! If you have even the tiniest amount of liquid the sample will LEAK into the next well AND THE NEXT!!! Basically initially i had semi-dry well and from Well 1 leaked up to WELL 4. everything was contaminated. THEN I got a new gel and dried them with an aspirator SUPER WELL....guess what in 3 minutes well 1 was already slowly creeping into well ² and 3. SOOOOO I would suggest to follow the FILL-WELLS-WITH-CATHODE Buffer (no coomassie version)-METHOD. Otherwise it will leak everywhere. I have no idea how this did not happen in this video or they simply brushed over it soooo quickly and u cannot see it.
    ². Secondly, when you put the Cathode buffer everything is VERY BLUE!!!! I have no idea how are they able to say "when the samples have entered the gel". this is very hard to see. maybe their room is very well lit with but my cold room is not that great and everything looks dark blue and nothing I can see. U have to keep this in mind to maybe bring a light.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 23, 2012 - 6:21 PM
  8. Dear K
    thanks for your interest in our protocol and your comments.
    Regarding your comments:
    1. Loading your samples dry into empty wells should not cause them to leak into neighbouring wells. This might only happen in case your wells were filled with liquid (as the BN buffer, in contrast to SDS sample buffer, dŒs not cause the sample to sink into the well). As shown in the video in our lab we remove the comb and load directly into the empty lanes without washing them or anything. I suggest you to check whether the wells themselves are fine after removing the comb. Additionally you should make sure to fill same volumes into every single well, use BN-lysis buffer for wells without sample.
    ². It is true that everything seems to be very blue after addition of blue cathode buffer into the inner chamber. Still, with some practice you will be able to identifiy the running front of your gel without any problems. Focus on the left and right side of the gel, where the glass plate of the gel is pressed onto the rubber of the running chamber. There you can easily see the staight line of the running front as the background is of the coulour of the rubber and not blue due to the buffer. You could also carefully remove the blue cathode buffer from the inner chamber using a pipette.
    Good luck for your next Blue Native!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 24, 2012 - 8:47 AM
  9. Thank you for the great reply. It is true that a blue front can be seen but veeeeeeeery slightly. Also eventually there are ² fronts. FIRST: between the transparent gel and the dark blue and SECONDLY: between the dark blue and the lighter blue buffer. Many papers say "stop eletrophoresis when the front reaches the bottom" I guess I assume this to be when the gel is completely BLUE. So I should ignore the second front?

    In addition, I am very curious about performing a Western directly after the Blue NATIVE. The procedure described here is after the ²D SDS which is different I think. I tried to find protocol for Western immediately after BN-Native but nothing online seems too clear. There are several differenced that I am trying to figure out. For example: the PVDF is completely stained, so how exactly do I destain it (I dont want to use too much acid etc.). Also, somewhere I read that NO BSA blocking step is necessary when doing BN-Native + PVDF membrane. Those are just a few questions that I have.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 31, 2012 - 3:32 PM
  10. For performing Western directly after 1st dimension BN-PAGE I recommend you to use the semidry system and normal transfer buffer. Of course your gel will be blue, but depending on what you do afterwards that is not a problem (e.g. immunodetection). To have a lighter blue gel you could also exchange blue cathode buffer with colorless cathode buffer during gel run as soon as your samples entered the separating gel.
    Blocking is still necessary! After transfer the membrane should be handeled normally. Please see also Swamy et al. ²006.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 1, 2012 - 3:31 AM
  11. Actually, you don't need to be worried about when to stop the run. According to the original paper [please find Anal. Biochem. ²17(²), ²²0-²30 (1994)], the pore-size distribution determines the individual migration ends of proteins. You could just run until the current stop (your power supply may show an error signal). Everything that could be separated in your gel will be stay at their own sites.

    Reply
    Posted by: Yeh-Lin L.
    February 3, 2012 - 2:58 AM
  12. Thank you so much for your replies. I still have some strange results.
    1. I noticed that in the Swamy et al ²006 paper you suggested to me and also the video here, your samples are TRANSPARENT, however the original Wittig and other papers have their sample with Coomassie Blue prior to loading. resulting in very very blue samples. I do not know if this is an issue.
    ². However when I run the sample they definitely remain as very very thick blue spots on my gel.
    3. Also, I run gel 1h then increase to 150-170V for another ²+ hours, the dark blue front reaches the bottom SORT OF (look at image), the thick BLUE spots are very visible, and also the upper half of the gel is lighter because of the second lighter cathode buffer. But I never get such a CLEAR and perfect line like yours. My DARK blue part of the gel remains there and as you see underneath the big blue spots there is nothing.
    PLEASE look at the image: http://tinypic.com/view.php?pic=110kcxh&s=5 (look at lanes 3-4-5)

    I am just confused, do I have too much sample. Why do I have such enormous blue spots very clearly visible. My proteins are transmembrane proteins that are very very highly over-expressed. Maybe I should load less? They should be sizes 60kDa, 90kDa at 150kDa. I am using the Bio-rad pre-casted Tris-HCl gels 4-15%.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 6, 2012 - 10:19 PM

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