Mekanik Dinamik Hücre Kültürü için Microfabricated platformlar

Published 12/26/2010
1 Comment
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Bu protokolde, teknolojinin dayandığı dikey yerinden mesajların microactuator dizi imalat, ve nasıl bu temel teknoloji, yüksek verimli mekanik dinamik hücre kültürü, hem de iki boyutlu ve üç boyutlu kültür yapmak için değiştirilebilir göstermektedir paradigmalar.

Cite this Article

Copy Citation

Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture. J. Vis. Exp. (46), e2224, doi:10.3791/2224 (2010).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Aynı anda bir çok kültür hücreleri mekanik uyaranlara başvuruda bulunamazlar mevcut biyoreaktör teknolojileri, in vitro hücre, doku mühendisliği, ilaç keşfi veya temel hücre biyolojisi çalışmaları için mechanobiological uyaranlara kombinasyonları yanıt olarak sistematik bir prob yeteneği sınırlıdır . Bu sorunu gidermek için, bir dizi yüksek verimli bir biçimde mekanik uyaranlara etkileri için ekran için tasarlanmış microfabricated platformları geliştirdik. Bu protokol, teknoloji tabanlı ve daha fazla bu temel teknolojisi, iki boyutlu ve her ikisi de yüksek verimli mekanik dinamik hücre kültürü yapmak için nasıl değiştirilebilir göstermek olduğu dikey yerinden mesajların microactuator dizi imalat gösteren üç boyutlu kültür paradigmalar.

Protocol

A. Aygıt tanımı ve işleyişi

Cihazlar çok katlı yumuşak litografi 1 polidimetilsiloksan (PDMS) kullanılarak üretilen ve microfabricated dizi boyunca tek tek hücre kültürü yerlerde mekanik koşullar aynı anda bir dizi üretme yeteneğine sahiptir. Bu protokol, pnömatik tahrikli microposts bir dizi imal adımları ilk, hem iki boyutlu (2B) ve üç boyutlu (3D) kültür paradigmaları mekanik dinamik kültür etkinleştirmek için cihaz değiştirmek için gerekli adımları takip açıklanmıştır. Microfabricated özetlenen yaklaşım mevcut macroscale sistemler üzerinde verim artar, ve çeşitli mekanik koşulları efektleri için en iyi tarama için uygundur.

Çalışma prensibi cihaz için bir dizi dikey olarak harekete microposts dayanmaktadır. Microposts özgürce askıya diyafram fabrikasyon olup, kaldırdı ve harekete diyaframın altında (Şekil 1) pozitif ve negatif basınç uygulayarak indirdi. Dizinin önemli bir özelliği, tek bir basınç kaynağı harekete diyafram boyutunu değiştirerek, bir dizi dizi boyunca düşey deplasmanlar elde etmek için kullanılan olabilir. Bu ilke, tek bir cihaz üzerinde mekanik uyarıcı koşulları çok sayıda hücresel yanıt hızla ekrana kullanılmaktadır.

Schaffer ve ark tarafından benzer macroscale bir tasarım. 2 dayanarak, tasarım, hücreler yükseltilmiş yükleme yazılan üzerinde kültür film fişleri gibi 2B yüzey deformasyon deneyimi sağlayan ikinci bir yazı üzerine kapanmıştır ve yağlanmış hücre kültürü filmi, içerir. Alternatif olarak, bir dizi hücre yüklü hidrojellerin yükleme ileti photopatterning 3D kültür hücreler basınç uyarılması için izin verir. Bu sistemleri kurma ayrıntılı talimatları uygulayın.

Pnömatik microactuator dizi B. Fabrikasyon

Pnömatik microactuator dizi imalatı, çok katlı PDMS yapılar sıkı uyum gerektirir. Bu zorlu, büzülme indüklenmiş uyum kayıt hataları nedeniyle. Bu adres için, biz bu konuda etkin 4 ortadan kaldırmak için gösterilen 'sandviç kalıp imalat "3 olarak adlandırılan bir fabrikasyon süreci, kullanın.

Malzeme Hazırlığı

  1. Çeşitli düzeylerde her biri için tek ya da çoklu-seviye SU-8 ustaları standart prosedürler kullanarak temiz imal edilir. Bu cihazlar için, yüksek lisans, uygulamaya bağlı olarak, 200-400 mikron kalınlığında. Üstatlar az 80 ° C üç gün önceden hardbaked.
  2. Temizlik cam slaytlar ve SU-8 ustaların, malzemelerin PDMS kür yapışmasını önlemek için, bir vakum odasında Silanlanmış. Bir fumehood, 60 mcL (tridecafluoro-1 ,1,2,2-tetrahydrooctyl) silanization ajan-1-trichlorosilane (Birleşik Kimyasal Teknolojiler, Bristol, PA) odasında bir petri pipetlenir. Çıplak cam ve SU-8 ustaları odasına yerleştirilen ve gece vakum altında tutulur.
  3. İki köpük pedler (zanaat tedarik mağazalarında) ve bir havai inkjet asetat film, sandviç kalıp imalatı için kullanılan SU-8 master biraz daha büyük boyutlarda kesilir.

Sandviç Kalıp İmalat

  1. Çok katmanlı cihazın her katmanı bu yöntemi kullanarak bezenmiş bir PDMS katmanı gerektirir. Şekil 1'de şematik sandviç kalıp üretim süreci sağlanır.
  2. PDMS monomer ve çapraz bağlayıcı standart 10:1 oranını iyice karıştırılır. Sertleşmemiş PDMS karışım 3 mL önceden fabrikasyon SU-8 master üzerine yatırılır ve bir vakum odasında gazlar.
  3. Köpük yastık ve SU-8 ana pleksiglas bir taban plakası üzerine yerleştirilir.
  4. Şeffaflık dikkatli bir şekilde, herhangi bir hava kabarcığı yakalama önlemek için emin olun, sertleşmemiş PDMS üzerine indirilir. Mürekkep Püskürtmeli asetat, pürüzlü ve pürüzsüz bir yan var ve pürüzsüz yan temas sertleşmemiş PDMS önemlidir.
  5. Silanlanmış bir cam slayt ikinci köpük yastık ve bir pleksiglas üst plaka altında, şeffaflık üstüne yerleştirilir. Sandviç sonra bir C-klemp kullanılarak birlikte kelepçelenir.
  6. PDMS sandviç, 80 ° C'de en az 4 saat süreyle bir fırında iyileşmişti.
  7. Sandviç fırın kaldırılır ve kelepçe çıkarmadan önce soğutmak için izin verilir.
  8. Klemp kaldırıldı ve sandviç demonte ve köpük pedler atılır. Şeffaflık desenli PDMS filmi dikkatli bir şekilde koruyarak, SU-8 ustadan uzak soyulmuş.
  9. Bu desenli PDMS katmanları ve taşıma şeffaflık katmanları kullanmak için hazır olana kadar sonra tozsuz bir ortamda saklanabilir. Biz başarıyla fark zararlı etkileri, iki aylık PDMS katmanları kullandık.

Çok katmanlı bir cihaz oluşturulması

t "> microactuator dizi imalat şematik Şekil 2A sağlanır ve aktüatörler işlem cihaz imal Şekil 2B ve C. gösterilir:

  1. En alt desenli PDMS katmanlı sandviç kalıp imalatı ile hazırlanmıştır. Bu deneyler için, çapı 600 ile 1200μm arasında değişen yuvarlak desenler kullanılmıştır.
  2. PDMS katmanı sonra temiz bir cam slayt aktarılır. Corona deşarj ünitesi, oksijen plazma ile PDMS ve cam yüzeyler tedavi etmek için kullanılır ve iki yüzey birbiri ile temas halinde yerleştirilir. Yığını sonra 80 ocak yerleştirilmiştir ° C yapıştırma işlemini tamamlamak için. Şeffaflık sonra uzak soyulmuş ve atılmış olabilir. Bu süreçte, desenli PDMS filmi tek tek katmanların büzülme önlenmesi, katı bir substrat piyasaya asla.
  3. Sandviç kalıp adım, SU-8 özellikleri ve şeffaflık arasındaki sıkılmış henüz PDMS ince filmlerin başarısı olarak kaldırılması gerekir. Bu bir Stereoskop el altında bir 25G iğne kullanılarak yapılabilir.
  4. Istenilen diyafram ve sonrası yapının olumsuz bir kopyası kalıp olarak ikinci sandviç kalıp tabakası oluşur. Geniş alan SU-8 ustaları imalatı zordur, çünkü bu, ancak alternatif imalat süreçlerinin kullanımı, bu fazladan adım ortadan kaldırabilir. Bu gösteriye çapında dairesel Mesajları 500 mikron kullanılmıştır. Negatif çoğaltma kalıp Silanlanmış ve geçici olarak, çift taraflı bant kullanarak bir bardak slayt yapıştırılmış. Kürleşmemiş PDMS, yatırılan gazlar ve 60 mikron kalınlığında bir harekete diyafram verimli, 1000 RPM hızında 45 saniye boyunca bu sandviç kalıp katman üzerine spin-kaplanmıştır. Spin-kaplı PDMS katmanı 80 kısmen tedavi ° PDMS yapışkan ama dokundu kalıcı olarak deforme etmez C ~ 20 dakika kadar veya.
  5. , Daha sonra, plazma tedavi ters ve bir ölçüye göre hizalama yerleştirilir kısmen tedavi PDMS katman, cam slayt ve çift taraflı bant kaldırılır. Hizalama bir vakum aynanın bir micromanipulator (Siskiyou Misyon Viego, CA, USA) monte oluşur. Ilk PDMS katmanı, vakum mandreni altında (Newmark, Grants Pass, OR, ABD) plazma ile tedavi edilen ve bir döner sahne üzerine yerleştirilen sonra, iki kat arasındaki uyum bir Navitar 12x optik zum makine görme sistemi (Navitar kullanarak görülmektedir; Rochester, NY, ABD).
  6. Katmanları manipülatör kul ve dikkatli bir şekilde temas getirdi. Sandviç hizalama sonra kaldırılır ve 80 ° C'de 30 dakika daha bir fırın tamamen iyileşen. Şeffaflık ve Silanlanmış çoğaltma PDMS kalıp daha sonra cihazdan soyulmuş ve atılmalıdır. Cihaz 80 ° C'de en az dört saat sonra tamamen iyileşmiş durumda.
  7. Mekanik stimülasyonu deneyi yürütülmektedir türüne bağlı olarak, ek PDMS katmanları sonra özetlenen sürecin tekrarlayarak bu baz cihaza bağlanmış olabilir. Detayları mekanik stimülasyonu deneyler çeşitli türleri için C ve D bölümleri

Konnektörler

  1. Cihaz tamamlandıktan sonra, bir iğne bağlantı noktasında PDMS tabakasını temizlemek için de kullanılabilir.
  2. Nanoport (Upchurch Bilimsel Oak Harbor, WA, ABD) Ticari konektörler sonra dış boru ile arayüz kullanılabilir. Ticari konektörler yüksekliği gereksinimleri önlemek için, ve bu sayede cihaz kaplar gibi standart petri kaplarına, aşağıdaki gibi biz kendi imal.
  3. PDMS yaklaşık 35 g (Rochester, NY, ABD Nunc) çok iyi bir tepsi dökme ve tedavi. Cihaz soyulmuş ve küçük bir conta bölümleri oyulmuş, 1 / 8 "delik bir yumruk kullanarak kaldırılır.
  4. Körelmiş bir 18G iğne çekirdek dışarı conta tarafında bir bölümü kullanılır. Küçük bir 21G iğne 18G iğne çekilerek önce merkezi çekirdek kaldırmak için kullanılır.
  5. Yaklaşık 15g PDMS, döküm ve tedavi çok iyi tepsisi kapağı, kabuğu soyulmuş ve benzer boyuttaki bölüm halinde kesilmiş. Bu bölüm, daha sonra seloteyip ile temizlenmelidir conta üst plazma gümrüklü ve birim delikli tarafı aşağı, plazma cihaz bağlı.
  6. Sonra ikinci bir künt 18G iğne, renkli plastik döner konektöründen ayrılmış özlü deliğe yerleştirilen ve PDMS birkaç damla ile kapatılmış. Ortaya çıkan konektörü oldukça etkili, ekonomik ve hava kabarcıklarının sıvı dolum aşamalarında kanalları girmesini engellemek için yeterince büyük bir ölü boşluk hacmine sahiptir.

C. Mekanik aktif 2D kültür substratları

Tahrikli microposts dizi, hücrelerin kültürü olan bir asma polimer film, çeşitli gerilme profilleri oluşturmak için kullanılan olabilir. Yağlanmış bir film haline yazılan Raising yazılan etrafında kayma ve deforme film neden olur. Equibiaxial bir gerilme dağılımı dairesel bir yükleme yazılan sonuçlarını kullanarak, ancaktasarım sonrası farklı şekillerde çok yönlü, çeşitli gerilme alanları oluşturmak için kullanılabilir. 2D kültürü deneyleri için (Şekil 3 de şematik) aktüatör dizi değiştirmek için:

  1. Bond cihaz için bir üçüncü PDMS katmanı olarak Şekil 3a gösterilmiştir. Iki katman yapısı, üçüncü PDMS katman oluşur. Alt daire tahrikli microposts altında harekete boşluğunun boyutunu eşleşir. Üst dairenin çapı 100μm yükleme mesajların çapından daha büyük. 200 mikron Mikrokanallı geniş bir bağlantı alanı için bu özellikleri bağlanır ve yükleme mesajları ve kültür film yağlamak için kullanılacaktır.
  2. Üretiyor ve cihaza bağ konektörler, daha önce açıklandığı gibi.
  3. Spin kat düzgün bir saydamlık yüzüne PDMS 10-15 mikron kalınlığında katman (dönüş parametreleri: 4000 RPM, 120 saniye). En az 4 saat süreyle 80 ° C'de Cure.
  4. Mesaj dizi düşürücü aktüatörlere appy düşük seviyeli bir vakum (Barnant Hava Cadet aspirasyon pompası),.
  5. Plazma tedavi ve tahvil tahrikli microdevice spin kaplı PDMS film. 80 ocak Yeri ° C'de 10 dakika. Mesajları ve kültürü filmi, kısa bir süre için hidrofilik kalacaktır.
  6. Deiyonize su çözeltisi% 90 gliserol ile yağlama kanalları doldurun. Yağlama için ek olarak, bu formülasyon, sürtünme katsayıları azaltarak süresiz PDMS hydrophilicity korur. Hava kabarcıkları yazılan ve kültür film arasında sıkışıp kalacaktır. 40 ° C'de bir ocak cihazı yerleştirin ve küçük bir basınç artışı neden kanal içine yağ enjekte etmeye devam ediyor. Birkaç dakika sonra, hava kabarcıkları PDMS yoluyla yayılır ve tüm yüzeyleri yağlanmalıdır.
  7. Ileti bırakmadan, negatif basınç çıkarın.
  8. Bir neşter kullanılarak, ince PDMS film etrafında kesti. Cihazdan destek şeffaflık dikkatlice soyulur.
  9. Plazma bağ cihaz kültür alanı etrafında el-cut PDMS conta.
  10. Biyolojik güvenlik kabininde 45 dakika sonra antiseptik bir UV ışık altında, 5 dakika boyunca% 70 etanol içinde sırılsıklam ve cihaz sterilize edin.
  11. Plazma 4 gecede 100 mcg / mL kolajen (ya da alternatif ECM proteini) ile yüzey ve inkübe ° C tedavisinde
  12. Cihaz fosfat salin (PBS), standart hücre kültürü protokolleri 10-15.000 hücre / cm 2 tohum hücreleri, tamponlu ile yıkayın.

Bu platform üzerinde yapılan microdevice çalışma ve biyolojik deneyler detaylı karakterizasyonu başka 7 yayınlanmıştır.

D. Mekanik aktif 3D hidrojeller

Cihaz üzerinde değişiklik yapmak da photopatterned sıkıştırma sağlamak için kullanılabilir. Yüksek verimli bir şekilde hücre yüklü, üç boyutlu hidrojeller. Bu örnekte, C3H10T1 / 2 fare mezenkimal kök hücreler encapsulating, 350 mikron çaplı polietilen glikol (PEG) hidrojel silindir oluşturur ve dizi boyunca 5 ila% 25 arasında değişen basınç suşları geçerlidir. Bu protokol daha ileri hidrojel fotopolimerizasyon kimyaları ile kullanılabilir. Üç boyutlu mechanobiology (Şekil 4'te şematik) deneyler için platform kullanmak için:

Cihaz üzerindeki değişiklikler:

  1. Mesaj gaz geçirgenliği azaltmak ve polimerizasyon kez PEG hidrojel sistemi geliştirmek için Parylene-C 1 mikron kalınlığında bir tabaka ile kaplayın. Bu serbest radikal tabanlı fotopolimerizasyon reaksiyon sitotoksik etkilerini azaltacaktır. Seloteyip Adet sonrası çevresindeki bölgeleri maskelemek için kullanılır ve cihaz (Özel Kaplama Sistemleri, Indianapolis, IN, ABD) bir PDS 2010 LabCoter 2 sistemi ile kaplanmıştır.
  2. Kaplı cihazla kaplama sistemi kaldırıldı ve seloteyip ileti konformal Parylene-C bir tabaka bırakarak soyulmuş.
  3. Propil metakrilat (Trimetoksisilil) 2 dakika süreyle% 95 etanol - Bir bardak lamel 3% 2 v / v çözüm daldırma 8 methacrylated konumundadır.
  4. % 100 etanol içinde lamel durulanır ve 100 pişmiş ° C metakrilat grupları, yüzeyde bırakır.
  5. A 200 mikron kalınlığında PDMS ayırıcı film petri döküm ve küçük bölümler halinde kesilir. Bu küçük bölümlerden Dört methacrylated lamel kenarında gümrüklü plazma.
  6. Ayırıcılar sonra plazma Parylene-C kaplı mesajlar kapsayan cihazın PDMS alanları, yapıştırılır.
  7. Cihaz% 70 etanol, çamaşır ve 45 dakika için bir biyolojik güvenlik kabini UV ışık antiseptik maruz kalma ile sterilize.

Yerinde polimerizasyon:

Hücre yüklü PEG hidrojeller sonra aşağıdaki gibi cihazlar 8,9 photolithographically desenli:

  1. Ve% 10 w / v PEG (8kDa, Sigma-Aldrich);% 10 w / v PEGDA hazırlayın (Arap, AL, ABD 3.4kDa, Laysan Bio)unsupplmented hücre kültür ortamı çözüm.
  2. 1-vinil-2-pyrolidinone photoinitiator stok solüsyonu, 100 mg / ml Irgacure 2959 (Tarrytown, NY, ABD Ciba Specialty Chemicals) hazırlayın.
  3. % 0.4 w / v photoinitiator bir konsantrasyon ile bir çözüm elde etmek için iki hazırlanan çözümler birlikte iyice karıştırın. Parçacık sterilize ve kaldırmak için 0.45 mikron şırınga filtre ile karışımı Filtre.
  4. Trypsinize hücre kültürleri ve iki kez istenen son nokta hücre konsantrasyonu, kültür ortamı bir hücre süspansiyonu hazırlamak.
  5. Hücre süspansiyonu ve filtrelenmiş hidrojel habercisi / photoinitiator çözüm 1:1 oranında karıştırın.
  6. Çözümü uzun bir 25G iğne kullanılarak microdevice içine enjekte edilir. Dikkatlice cihazın kabarcıkları yakalama kaçının.
  7. Baskılı bir şeffaflık maskesi cihaz yüzey hizalama işaretlerini hizalayın. Aygıt yüzeyinin 17.5 mW / cm 2 UV dozu sağlamak için UV aydınlatma sistemi kurun. 195 s için maske ile hidrojel aydınlatın Bu sefer bizim sistemi için optimize edilmiştir ve ayarlanabilir gerekebilir.
  8. Uzakta unpolymerized hidrojel habercisi çözüm PBS ile yıkayın ve kültür ortamı ile PBS yerini. Hidrojel yapıları sıkıştırmak için yükleniyor mesajları harekete.

Microdevice operasyon ve bu platform üzerinde yapılan biyolojik deneyler detaylı karakterizasyonu başka bir yerde 10 yayınlanmıştır.

E. Çevresel ekipman

Modifiye petri kaplarına cihazların kumandası sırasında hücre kültürlerinin kısırlık korumak için kullanılır. Körletilmeye ve elimden 18G iğne petri tarafında açılan bir delik içine epoxied. Boru (Clay Adams Intramedic PE190; VWR International, Arlington Heights, IL, ABD), bu konnektörler basın monte ve kontrollü solenoid vanalar ve basınç kaynağı bağlanır.

Cihazlara Basınçlar dış micropumps tarafından sağlanmaktadır. 2B deneyler için, pozitif basınç değerleri 30-55 kPa, gerilim kontrollü bir eksantrik diyafram pompası (Schwarzer Hassas, Almanya SP 500 EC-LC 4.5VDC) kullanılarak oluşturulmuştur. Bir darbe genişliği modülasyonu dayalı gerilim kontrolörü, basınç çıkışı kontrol etmek için uygulanan gerilimi değiştirmek için kullanılır. Solenoid vanalar ve manifoldlar (S10MM-30-12-3 ve MSV10-1; Pneumadyne, Plymouth, MN, ABD), döngüsel bir basınç dalga yaratmak için kullanılır. Vanalar, bir kare dalga fonksiyonu üreteci tarafından kontrol edilen bir 12 V sinyal ile harekete geçirilir.

F. Aygıt karakterizasyonu ve kullanımı

Cihazın üzerinde Görüntüleme

Cihaz üzerinde görüntüleme hücreleri veya partikülleri ile ortak bir sorun yükleme sonrası destek PDMS filmin altında damlacıklarının yoğunlaşma nedeniyle zayıf optik çözünürlük. Bu yoğunlaşma, inkübatör içindeki hava sıcaklığı ve nem farklılıkları ve fiksasyon sonra veya bir mikroskop sahnede ortaya çıkar. Bu sorunu gidermek için:

  1. Açık bir rezervuar basıncı giriş portuna bağlayın ve deiyonize su ile doldurun. Biz bir kolaylık sağlamak için luer kilit bağlantısı ile açık bir şırınga kullanın.
  2. Bir vakum odasında cihaz ve dolu rezervuar yerleştirin ve aşağı pompa.
  3. 5 dakika bekleyin ve atmosferik basınç odasının getirmek. Iki ya da üç kez tekrarlayın. Hava kanalları cihazın yerinden olduğu gibi, damlacık kondanseleri ortadan kaldırılması ve net optik mikroskopi için bir yol sağlayan, rezervuar su ile değiştirilir.
  4. Parlak bir alan veya floresan mikroskobu kullanarak kültür alanları.

Canlı hücre görüntüleme için, bu yordamı cihazlar hücreleri ekim önce yapılabilir. Ancak, kanallar cihaz birimleri arasında herhangi bir viskoz basınç kayıplarını önlemek için yeterince büyük tasarlanmış olması gerekir.

Boncuk takip ederek karakterizasyonu Gerinim

2B kültür sistemlerinde:

  1. Istenen konsantrasyona metanol, 1 mikron çaplı floresan boncuk (Fisher, IN Kaküller Laboratories) sulandırınız. Orijinal konsantrasyonlarda (boncuk tampon çözelti% 1 katı) 1:150 çözeltiler bizim ihtiyaçlarımız için uygun olduğu tespit edilmiştir.
  2. Plazma aygıt yüzeyinin tedavi ve boncuk süspansiyonu 5-10 mcL yatırmak.
  3. Metanol için buharlaşması için bekleyin. Boncuk konsantrasyonu çok düşük ise tekrarlayın.
  4. Görüntü geri kalanı hücre kültür alanları ve yük altında.
  5. Açık kaynak otomatik partikül izleme algoritmaları sonra boncuk değiştirmeler izlemek için ImageJ (NIH) kullanılabilir.
  6. Deplasman büyüklüğü, yönü ve konumu parametreleri sonra cihaz yüzeyi üzerinde yük alanları karakterize etmek için matematiksel bir model olarak kullanılabilir.

3D sistemlerinde suşları karakterize etmek için benzer bir prosedür takip edilebilir. H floresan boncuk bir miktar karıştırınydrogel habercisi çözüm. PEG hidrojel sistemi durumda, gözenek boyutları 1 mikron çaplı boncuk oranla çok daha küçük. Boncuk hidrojel kapsüllü ve sistemi konfokal bir mikroskop kullanılarak görüntülü olabilir. Boncuk değiştirmeler sonra, takip, analiz ve deformasyon modeli monte edilebilir.

G. Temsilcisi Sonuçlar

Aygıt fabrikasyonu, karakterizasyonu ve işletilmesi için Temsilcisi sonuçları Şekil 5 ve 6'da verilmiştir.

Şekil 1
Şekil 1. Sandviç kalıp üretim süreci. (A) Bir genel şeffaflık dikkatle SU-8 master sertleşmemiş PDMS üzerine indirilir. (B) sandviç, bir köpük, cam ve metal yığını yerleştirilir ve basınç altında bir fırın içinde tedavi. (C) yığını demonte ve şeffaflık desenli PDMS katman 3 istinat uzakta soyulmuş. Fizik Enstitüsü izni ile yeniden basılmıştır.

Şekil 2
Şekil 2 (A) dinlenme ve (B) tahrikli dikey tahrikli micropost şematik. (C), çok katlı imalat sürecinin şematik 3 microposts bir dizi yapmak için gereklidir . Fizik Enstitüsü izni ile uyarlanmıştır.

Şekil 3
Şekil 3 microactuator dizi değiştirmek için bir deforme iki boyutlu substrat 7 kültüre hücrelerin deneyler işleyin. Royal Society Kimya izni ile yeniden basılmıştır http://dx.doi.org/10.1039/B914460A .

Şekil 4
Şekil 4 üç boyutlu photopatterned hidrojel kültür hücreleri için deneyler microactuator dizi değişiklik Süreç 10 oluşturur. Elsevier izni ile yeniden basılmıştır.

Şekil 5
Şekil 5 (A) Örnek 2D mechanostimulatory kültür cihaz. Kırmızı boya, yağlama kanalı işaretlemek için kullanılan tahrik basınç dağıtım kanalları ve mavi boya işaretlemek için kullanılır. (B) bir yük karakterizasyonu deney örnek görüntü. Yeşil noktalar deforme yerleri 7 temsil ederken, kırmızı lekeler, boncuk değiştirmemiş konumu temsil eder. Royal Society Kimya izni ile yeniden basılmıştır http://dx.doi.org/10.1039/B914460A .

Şekil 6
Şekil 6. (A) Örnek 3D basınç deneyleri için cihaz. Yeşil boya harekete basınçlı kanal işaretlemek için kullanılır. (B) (C) hidrojel sonrası üst desenli inşa micropost dizi Yukarıdan-aşağıya. (D, E) Yan yeniden inşa hidrojel floresan boncuk görüntüler 3D kültür sistemi 10 suşu karakterizasyonu süreci gösteren, (D) dinlenme ve (E) 55 kPa harekete baskıların altında inşa. Elsevier izni ile yeniden basılmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kavramsal olarak basit olsa da, aygıt fabrikasyonu, deneysel beceri ve uygulama. Özellikle 2D hücre kültürü söz konusu olduğunda, cihaz çoklu katmanlar uyum, özellikle geniş bir alan bir dizi üzerinde, zorlu olabilir. Uygulamayı konuşmak gerekirse, güvenilir, çoklu katmanlar bitişik özellikleri arasındaki boşluk 50 mm ile hoşgörü cihazlar kullanarak% 100 hizalama başarı oranı elde edebilirsiniz. Ayrıca başarılı bir şekilde 15 mikron olarak düşük tolerans ile uyum göstermiştir, ancak gerekli hizalama zaman çok daha büyük ve daha düşük bir başarı oranı elde edilir. Hizalama dizinin üzerine photopattern biyomalzemeler maske benzer zorlu, ancak mesajların hidrojel silindir karşılaştırıldığında oldukça büyük olduğu için tasarlanmış olabilir, bu sınırlama, hafifletilmesi.

Diğer sorunlar bu protokolü açıklanan malzemeler üzerinde hücre kültürü içerir. 2B germe sistemi, bir kültür film kısa vadeli deneylerin biyolojik soruşturma sınırlar PDMS kullanarak, hücre yapışma yüzey stimülasyonu 6 saat sonra önemli ölçüde etkilenmeye başlar. Bu PDMS yüzey 11, ya da hücre adezyon geliştirmek ve yapılan biyolojik deneyler 12 daha fazla esneklik sağlamak için klinik olarak daha anlamlı bir poliüretan malzeme, PDMS hücre kültürü substrat yerine kovalent bağlayıcı matriks proteinlerine tarafından giderilebilir . Hidrojel kimya açıklanan 3D sisteminde, sadece bir örnek olarak hazırlanmıştır. Yapışık hücrelere Uzun vadeli kültür kullanımı, alternatif doğal veya sentetik hidrojeller veya yapışkan ligandlar (standart PEGylation kimyaları kullanarak kolayca elde edilebilir) PEG matrisi 13 içine dahil gerektirir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgements

Biz, YS Kanada Doğal Bilimler ve Mühendislik Araştırma Konseyi ve Kanada Sağlık Araştırma Enstitüsü (CHRPJ 323.533-06), Ontario Yüksek Lisans Burs programı CM, Mikro ve Nano Mühendislik Sistemleri Kanada Araştırma Sandalyeler mali destek kabul CAS Mechanobiology.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard 184 PDMS Monomer and Crosslinker Kit Dow Corning
SU-8 masters
Silanization agent: (tridecafluoro-1, 1, 2, 2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane United Chemical Technologies
Foam pads Craft supply stores, 1-2 mm thick
Overhead inkjet transparencies Grand Toy
Plexiglass plates
C-clamp hardware store
Micromanipulator system Siskiyou, Inc.
Custom-made vaccum mount
Vision system, Navitar 12x zoom Navitar
Connecting tubes VWR international Clay Adam Intramedic PE190
Blunt 18G needles Small Parts (www.smallparts.com)
Eccentric diaphragm micropump Schwarzer Precision SP 500 EC-LC4.5V DC
Solenoid valves Pneumadyne S10MM-30-12-3
Solenoid manifold Pneumadyne MSV10-1
Function generator
3-(trimethoxysilyl) propyl methacrylate Sigma-Aldrich
Polyethylene glycol diacrylate 3.4 kDa Laysan Bio Inc.
Polyethylene glycol 8 kDa Sigma-Aldrich
Irgacure 2959 Ciba Specialty Chemicals
1-vinyl-2-pyrolidinone Sigma-Aldrich
Standard cell culture reagents

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
  2. Schaffer, J. L. Device for the application of a dynamic biaxially uniform and isotropic strain to a flexible cell culture membrane. J Orthop Res. 12, 709-719 (1994).
  3. Jo, B., Lerberghe, L. V. an, Motsegood, K., Beebe, D. Three-dimensional micro-channel fabrication in polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer. Journal of Microelectromechanical Systems. 9, 76-81 (2000).
  4. Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. Solving the shrinkage-induced PDMS alignment registration issue in multilayer soft lithography. J. Micromech. Microeng. 19, 065015-065015 (2009).
  5. Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a chip. 6, 1548-1549 (2006).
  6. Bongaerts, J., Fourtouni, K., Stokes, J. Soft-tribology: Lubrication in compliant PDMS-PDMS contact. Tribology International. 40, 1531-1542 (2007).
  7. Moraes, C., Chen, J. H., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated arrays for high-throughput screening of cellular response to cyclic substrate deformation. Lab on a chip. 10, 227-234 (2010).
  8. Liu, V. A., Bhatia, S. N. Three-dimensional photopatterning of hydrogels containing living cells. Biomedical Microdevices. 4, 257-266 (2002).
  9. Hahn, M. S. Photolithographic patterning of polyethylene glycol hydrogels. Biomaterials. 27, 2519-2524 (2006).
  10. Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays. Biomaterials. 31, 577-584 (2010).
  11. Wipff, P. J. The covalent attachment of adhesion molecules to silicone membranes for cell stretching applications. Biomaterials. 30, 1781-1789 (2009).
  12. Moraes, C. Integrating polyurethane culture substrates into poly(dimethylsiloxane) microdevices. Biomaterials. 30, 5241-5250 (2009).
  13. Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. Review: photopolymerizable and degradable biomaterials for tissue engineering applications. Tissue engineering. 13, 2369-2385 (2007).

Comments

1 Comment

  1. Great thoughts...
    Amazing ideas....

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2011 - 6:38 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats