IonFlux: automatisierte Patch-Clamp-System mit Plate Reader Simplicity - WERBUNG

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Summary

Die IonFlux automatisierte Patch-Clamp-System bietet einen hohen Durchsatz, kostengünstige Ionenkanal-Screening für eine breite Palette von Anwendungen Elektrophysiologie. Schnelle Verbindung Austausch, niedrige Kosten pro Datenpunkt und bequem Well-Platte Formate machen das System ideal sowohl für Ligand-und Spannungs-Ionenkanal-Ziele. Die IonFlux HT bietet eine branchenweit führende 10.000 Datenpunkte pro Tag, während die IonFlux 16 bietet echte automatisierte Patch-Clamp-Leistung für etwa die Kosten für einen manuellen Patch-Clamp-rig.

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Abstract

Ionenkanäle spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulation des zentralen Nervensystems und die Physiologie von Nerven und Muskeln. Als Ergebnis haben sie in zahlreichen Krankheitsbildern wie Diabetes und Epilepsie in Verbindung gebracht, und sind die führenden Angriffspunkte für neue Medikamente. Die Patch-Clamp-Methode ist der Goldstandard für die Beurteilung Ionenkanal-Aktivität in vitro. Wenn in einem manuellen Mode implementiert, ist der Patch-Clamp-Test auf rund 10 Datenpunkte pro Tag, die weit unterhalb der Schwelle für eine sinnvolle Wirkstoffforschung und-entwicklung Anstrengungen erforderlich ist begrenzt. Die IonFlux Plattform nutzt die proprietäre Well Plate Mikrofluidik-Technologie, um die Patch-Clamp-Methode in einer bequemen und hohen Durchsatz-Well-Platte-Format, das in zwei skalierbare Konfigurationen kommt eine breite Palette von Anwendungen, darunter sowohl Spannungs-und Liganden-gesteuerte Ionenkanäle unterbringen zu automatisieren. Die IonFlux HT ist für das Hochdurchsatz-Screening in der Wirkstoffforschung und Entwicklung geeignet. Diese Version ist in der Lage, bis zu 10.000 Datenpunkten pro Tag. Für zusätzliche Durchsatz kann bis zu vier IonFlux HT-Systeme um einen einzigen Liquid-Handling-Roboter für bis zu 40.000 Datenpunkten pro Tag angeordnet werden. Die niedrigen Kosten pro Datenpunkt und minimale Verbindung Nutzung machen das IonFlux HT ideal für Wirkstoff-Screening, Medikamentenentwicklung, Sicherheit Toxikologie und Ionenkanal-Forschung. Die IonFlux 16 ist eine kostengünstige Lösung für mittlere Durchsatz Anwendungen wie zur Entwicklung von Zelllinien, Mutanten-Screening und Assay-Entwicklung. Zum ersten Mal haben die Nutzer Zugang zu echtem automatisierte Patch-Clamp-Technik bei vergleichbaren Kosten einer manuellen Patch-Clamp-rig.

Protocol

1. IonFlux Systemübersicht

  1. Die IonFlux System besteht aus einem Tischgerät, eine proprietäre Mikrofluidikvorrichtung in einem SBS-Standard-Well-Platte-Format und eine vollständige Erfassung und Analyse-Software-Paket umfasst.
  2. Im Gegensatz zu anderen automatisierten Patch Clamp Instrumenten, hält die IonFlux Leser eine sehr kleine Stellfläche, die eng-ähnelt einem Platten-Lesegerät. Es passt am Prüfplatz, und verfügt Integration mit häufig verwendeten Laborautomation Roboter, so dass die IonFlux sich nahtlos in bestehende Hochdurchsatz-Screening-Workflows sowie Forschungslabors.
  3. Die IonFlux nutzt Ensemble Aufnahme, was bedeutet, dass eine Bevölkerung von 20 Zellen in jeder Aufnahme Zone gepatcht sind, und ihre Ströme werden gemittelt, um einen einzigen Datenpunkt zu produzieren bedeutet. Dieser Ansatz führt zu einer hohen Erfolgsquote und minimiert den Einfluss von Zell-Variabilität.
  4. Jeder 384-Well-Platte verarbeiten können 256 verschiedene Verbindungen und produzieren 512 Datenpunkte. Die 96-Well-Platte mit dem IonFlux 16 Prozesse verwendeten 64 Verbindungen und produziert 128 Daten Punkte.
  5. Mit der Fähigkeit, einen hohen Durchsatz Elektrophysiologie Bildschirmen laufen öffnet die Tür zu einer Vielzahl von Ionenkanal-Experimente. Allgemeine Anwendungen umfassen Experimente mit Ligand gated Kanäle wie die GABA und Nikotinsäure-Rezeptoren, spannungsgesteuerten Kanäle wie die Natrium-und Kalium-Kanäle, Sicherheit und Toxikologie mit Schwerpunkt auf den hERG Kaliumkanals. Mutant und Zelllinie Bildschirme können auch durchgeführt werden. Darüber hinaus ermöglicht das IonFlux Analyse der funktionalen Expression von Ionenkanälen.

2. Datenerfassung und-analyse

  1. Die IonFlux System wird mit einer fortgeschrittenen Software-Paket für die Datenerfassung und-analyse. Sobald die Software geladen ist, wird dem Anwender drei Hauptfenster: Setup, Runtime und Datenanalyse.
  2. Das Setup-Modus enthält alle Steuerelemente benötigt, um ein Experiment zu definieren. In diesem Modus werden Experimente initialisiert und ganze oder halbe Platte bezeichnet wird. Die Tabelle der verwendeten Verbindungen ist auch in Set-up Modus importiert.
  3. Prime, Trap, Break, and Data Acquisition: In der Experimental Sequence Registerkarte werden die Parameter für die vier Phasen des Experiments eingestellt. Hier werden die Spannung Protokolle definiert.
  4. Die Runtime-Modus zeigt die Daten, wie sie gesammelt werden. Die Real-time Sweep-Fenster zeigt Ströme bei jedem Spannungsimpuls für jeden Kanal erzeugt. Der experimentelle Fortschritt wird ebenfalls berichtet.
  5. Die Datenanalyse-Modus ermöglicht eine schnelle Überprüfung und Analyse der abgeschlossenen Experimente. Die Werkzeuge sind für die Anzeige von Sweep und Trace-Daten, sowie für die Protokollierung bestimmter Ereignisse wie z. B. Verbindung Einführung zur Verfügung gestellt. Ein Hit Map-Modul hilft bei der Identifizierung der vielversprechendsten Verbindungen in den Bildschirm. Alle Daten können einfach in. Csv-Format in Excel und andere Datenbank-Anwendungen exportiert werden.

3. IonFlux Anwendungen - GABAA-Modulatoren

  1. Eine Vielzahl von Experimenten und Ziel-Bildschirme können über die IonFlux-System durchgeführt werden. Hier ist ein Beispiel zum Testen auf Modulatoren des menschlichen GABA-A-Rezeptor, in HEK293 Zellen von Millipore ausgedrückt demonstriert. Diese Liganden-gesteuerte Chlorid-Kanal ist in ZNS-Hemmung beteiligt sind, stellt somit einen wichtigen Angriffspunkt für Medikamente bei Epilepsie, Angstzuständen und Schlaflosigkeit.
  2. Um Screening-Assays wurden Zell-Ensembles zu EC20 Konzentrationen der nativen Ligand GABA ausgesetzt sind, in Gegenwart von aufsteigenden Konzentrationen von Modulator Substanzen, die an der allosterischen Seite auf den Rezeptor binden.
  3. Die Kurven zeigen Dosis-Wirkungs-Kurven für zwei positive allosterische Modulatoren in der Benzodiazepin-Klasse, nämlich Triazolam und Diazepam, für die EC50-Werte von 3 nM und 0,5 nM erhalten.
  4. Der Modulator-abhängige Verschiebung der scheinbaren GABA-Affinität wurde dann von kumulativ Anwendung verschiedener GABA-Konzentrationen in der Gegenwart einer festen Konzentration des Modulators, in diesem Fall 3 uM Diazepam bestimmt.
  5. Diese Art von Test ist der Flow-Through-Fluidik-Design, erhältlich in den IonFlux Instrumente aktiviert. Die EC50 für GABA wurde von etwa 1 uM zu niedrigeren Konzentrationen durch erhöhte Bindungsaffinität in der Gegenwart des Modulators verschoben.

4. IonFlux Anwendungen - Blocker neuronaler hNav1.8 Sodium Channel

  1. Die IonFlux Instrument erleichtert auch andere pharmakologische Experimente, darunter das Beispiel hier typisch für Blocker des neuronalen hNav1.8 Natrium-Kanal, einem spannungsgesteuerten Kanal in der Wahrnehmung von Schmerzen beteiligt ist. In diesem Test wurde der Na +-Kanal, in HEK293 Zellen exprimiert durch Voltage-Clamp-Schritten von -120 mV bis 0 mV aktiviert, angewendet jede Sekunde.
  2. Dieses Protokoll sieht daher Informationen über Stärkungsmittel Block des Kanals, da der Kanal wieder in den ausgeruhten Zustand zwischen depolarizatIonen. Kumulierte Blocker-Dosis-Wirkungs-Kurven sind für die Lokalanästhetika Lidocain und Tetracain illustriert sind, IC50-Werte von 320 nM und 34 nM bzw..
  3. In einem zweiten Diagramm ist die Lidocain Affinität für hNaV1.8, dass für hNaV1.7, anderen spannungsabhängigen Na +-Kanal in Schmerzempfindung beteiligt verglichen. Die IC50 für hNaV 1.7 wurde festgestellt, dass 3 mM und enthüllt eine zehnfache geringere Affinität, wenn dieser Kanal bindet Lidocain, verglichen mit hNaV1.8 werden.

5. IonFlux Anwendungen - hERG Screening

  1. Die IonFlux Gerät kann auch für die Sicherheit der Pharmakologie Anwendungen wie hERG Screening eingesetzt werden. Die hERG Kaliumkanals hat in unerwünschter kardialer Ereignisse mit diversen Drogen auf dem Markt verbundene gebracht worden, was zu ihrem Rückzug, und es ist nun erforderlich, dass alle neuer Wirkstoffe gegen diesen Kanal zu sehen sein.
  2. Blocker Dosis-Wirkungs-Kurven wurden für charakteristische Spannungs-Abhängigkeit hERG Kanälen in CHO-Zellen für drei häufig verwendete Referenz-Verbindungen, nämlich Terfenadin, Cisaprid und Chinidin ausgedrückt durchgeführt.
  3. Die Grafiken zeigen die typischen aktuelle Profil erhalten, wenn hERG Kanäle aktiviert werden durch ein Zwei-Puls-Protokoll, welches notwendig ist, wegen seiner schnellen Inaktivierung bewerten, wie zum hERG Tail-Ströme zu offenbaren. Die Grafiken zeigen die Aktivierung Spannungs-Abhängigkeit und Berichtigung Eigenschaften des hERG Strom in der IonFlux Instrument aufgezeichnet.
  4. Diese Aufnahmen eng replizieren akzeptiert Kanal Verhalten in der Literatur vertreten. Die Blocker-Dosis-Wirkungs-Kurven zeigen IC50-Werte für die drei Referenz-Verbindungen von 60 nM, 160 nM und 1 mM.

Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

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