IonFlux: Sistema automatico di patch clamp con semplicità Plate Reader - PUBBLICITA '

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Summary

Il sistema automatico IonFlux patch clamp fornisce un throughput elevato e conveniente lo screening dei canali ionici per una vasta gamma di applicazioni elettrofisiologia. Scambio composto veloce, a basso costo per punto i dati, i formati e comoda piastra ben rendono il sistema ideale sia per ligando e gli obiettivi di ioni voltaggio-dipendenti del canale. L'HT IonFlux fornisce un leader del settore 10.000 punti dati al giorno, mentre il IonFlux 16 fornisce vere prestazioni automatizzate patch clamp per circa il costo di un impianto manuale patch clamp.

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Abstract

Canali ionici hanno un ruolo critico nella regolazione del sistema nervoso centrale e la fisiologia dei nervi e dei muscoli. Di conseguenza, essi sono stati implicati in numerose condizioni patologiche come il diabete e l'epilessia, e sono obiettivi importanti per nuovi farmaci. Il metodo di patch clamp è il gold standard per la valutazione delle attività del canale ionico in vitro. Quando viene implementato in modo manuale, il saggio patch clamp è limitato a circa 10 punti di dati al giorno, che è ben al di sotto della soglia necessaria per la scoperta della droga significativo e sforzi di sviluppo. La piattaforma IonFlux utilizza la tecnologia proprietaria pozzetti Microfluidic per automatizzare il metodo di patch clamp in un comodo formato e alta velocità piastra bene che è disponibile in due configurazioni scalabili per soddisfare una vasta gamma di applicazioni, tra cui sia tensione e ligando-canali ionici. L'HT IonFlux è adatto per lo screening ad alto rendimento nella scoperta della droga e dello sviluppo. Questa versione è in grado di produrre fino a 10.000 punti dati al giorno. Per ulteriori velocità, fino a quattro IonFlux sistemi HT possono essere disposte intorno ad un singolo robot di manipolazione dei liquidi per un massimo di 40.000 punti dati al giorno. Il basso costo per punto el'uso di dati composto minimo rendono l'ideale IonFlux HT per lo screening di stupefacenti, lo sviluppo di farmaci, tossicologia di sicurezza, e la ricerca dei canali ionici. Il IonFlux 16 è una soluzione conveniente per applicazioni ad moderato come lo sviluppo di linee cellulari, screening mutante, e sviluppo di analisi. Per la prima volta, gli utenti hanno accesso alla vera tecnologia automatica patch clamp ad un costo paragonabile a un impianto di perforazione manuale patch clamp.

Protocol

1. IonFlux Panoramica del sistema

  1. Il sistema IonFlux è composta da uno strumento da banco, un dispositivo di proprietà microfluidi in un SBS formato standard pozzetti, e un'acquisizione completa e pacchetto software di analisi.
  2. A differenza di altri strumenti di patch clamp automatizzati, il lettore IonFlux mantiene un ingombro molto ridotto, che da vicino, assomiglia ad un lettore di piastre. Si adatta facilmente sul banco, e ha a disposizione l'integrazione con i robot di laboratorio di uso comune automazione, consentendo al IonFlux per adattarsi perfettamente nei flussi di lavoro esistenti ad alta velocità di screening nonché laboratori di ricerca.
  3. Il IonFlux utilizza registrazione insieme, il che significa che una popolazione di 20 celle sono patchati in ogni zona di registrazione, e le loro correnti viene calcolata la media per produrre un unico punto di dati. Questo approccio produce un alto tasso di successo e minimizza l'effetto della variabilità delle cellule.
  4. Ogni piastra da 384 pozzetti in grado di elaborare 256 composti unici e produrre 512 punti dati. La piastra a 96 pozzetti utilizzati con il IonFlux 16 processi 64 composti e produce 128 punti dati.
  5. Avere la possibilità di eseguire elettrofisiologia schermi ad alta velocità apre le porte ad una vasta gamma di esperimenti canale ionico. Le applicazioni più comuni includono esperimenti con ligando canali gated come i recettori GABA e nicotinici, tensione canali gated come i canali del sodio e potassio, e tossicologia sicurezza concentrandosi sul canale del potassio hERG. Schermi linea mutante e cellulare può anche essere eseguita. Inoltre, il IonFlux consente l'analisi della espressione funzionale di canali ionici.

2. Acquisizione dati e analisi

  1. IonFlux Il sistema viene fornito con un pacchetto software avanzato per l'acquisizione dati e analisi. Una volta che il software viene caricato, l'utente vedrà tre schermate principali: installazione, Runtime e analisi dei dati.
  2. La modalità di installazione contiene tutti i controlli necessari per definire un esperimento. In questa modalità, gli esperimenti vengono inizializzati e piastra intero o metà è designata. La tabella di composti utilizzati è anche importate in modalità d'impostazione.
  3. Nella scheda Sequenza sperimentale, i parametri sono fissati per le quattro fasi dell'esperimento: Primo, Trappola, Break, e acquisizione dati. Qui, i protocolli di tensione sono definiti.
  4. La modalità Runtime mostra i dati che vengono raccolti. Il tempo reale Finestra Sweep visualizza correnti generate nel corso di ogni impulso di tensione per ogni canale. Progressi sperimentali è anche riferito.
  5. L'analisi dei dati consente di rivedere in modalità rapida e analisi degli esperimenti completati. Strumenti sono previste per la visualizzazione dei dati sweep e traccia, così come per la registrazione degli eventi specifici come introduzione composto. Un modulo Mappa Hit aiuta a identificare i composti più promettenti nella schermata. Tutti i dati possono essere facilmente esportati in formato. Csv per applicazioni di database Excel e altri.

3. Applicazioni IonFlux - Modulatori GABAA

  1. Una vasta gamma di esperimenti e gli schermi di destinazione può essere effettuata sul sistema IonFlux. Qui, un esempio è dimostrato saggio di modulatori della persona umana recettori GABA-A, espresso in cellule HEK293 da Millipore. Questo ligando-dipendenti canale del cloro è coinvolto nella inibizione del SNC, che costituisce pertanto un importante bersaglio farmacologico in epilessia, ansia e insonnia.
  2. Per eseguire il test di screening, insiemi di cellule EC20 sono stati esposti a concentrazioni del ligando GABA nativo, in presenza di concentrazioni di sostanze ascendente modulatore che si legano al sito allosterico del recettore.
  3. I grafici mostrano curve dose-risposta per due modulatori allosterici positivi nella classe delle benzodiazepine, cioè triazolam e diazepam, per i quali sono stati ottenuti valori di EC50 di 3 nM e 0,5 micron.
  4. Il modulatore-dipendente spostamento apparente affinità del GABA è stato quindi determinato da cumulativamente applicando diverse concentrazioni di GABA, in presenza di una concentrazione fissa del modulatore, in questo caso, 3 mM diazepam.
  5. Questo tipo di esperimento è abilitato per il flusso attraverso il design fluido disponibile negli strumenti IonFlux. L'EC50 per GABA è stato spostato di circa 1 micron a concentrazioni più basse a causa di una maggiore affinità di legame, in presenza del modulatore.

4. Applicazioni IonFlux - bloccanti del canale del sodio neuronali hNav1.8

  1. Lo strumento IonFlux facilita anche altri esperimenti farmacologici, tra cui il tipico esempio qui mostrato per bloccanti del neurone hNav1.8 canale del sodio, un canale voltaggio-dipendenti coinvolti nella percezione del dolore. In questo saggio, il Na + canale, espresso in cellule HEK293 è stato attivato da passi clamp di tensione da -120 mV a 0 mV, applicata ogni secondo.
  2. Questo protocollo fornisce quindi informazioni sul blocco tonico del canale, dal momento che il canale di ri-entra nello stato di riposo tra depolarizationi. Cumulativa bloccante curve dose-risposta sono illustrati per l'anestesia locale lidocaina e tetracaina, fornendo valori di IC50 di 320 mM e 34 mM, rispettivamente.
  3. In un secondo grafico, l'affinità lidocaina per hNaV1.8 è confrontata con quella per hNaV1.7, un altro voltaggio-dipendenti del canale Na + coinvolti nella sensazione di dolore. L'IC50 per hNaV 1,7 è risultato essere di 3 mm, rivelando dieci volte minore affinità quando questo canale si lega lidocaina, rispetto al hNaV1.8.

5. Applicazioni IonFlux - Screening hERG

  1. Lo strumento IonFlux può essere utilizzato anche per applicazioni di sicurezza farmacologica come lo screening hERG. Il canale di potassio hERG è stato implicato in eventi cardiaci avversi associati a farmaci diversi sul mercato, portando a loro ritiro, ed è ora necessario che tutti i composti nuovo farmaco essere esaminate contro questo canale.
  2. Blocker curve dose-risposta sono stati eseguiti per la caratteristica tensione-dipendenza canali hERG espressa in cellule CHO per tre composti di riferimento comunemente utilizzato, cioè terfenadina, cisapride e chinidina.
  3. I grafici mostrano il profilo tipico di corrente ottenuto quando i canali hERG sono attivati ​​da due impulsi protocollo, che è necessaria a causa del suo tasso di inattivazione rapida, in quanto utilizzata per rivelare le correnti coda hERG. I grafici mostrano l'attivazione voltaggio-dipendenza e le proprietà di rettificazione della corrente hERG registrato nello strumento IonFlux.
  4. Queste registrazioni strettamente replicare il comportamento accettato canale rappresentato in letteratura. Le curve dose-risposta bloccante rivelano valori di IC50 per i tre composti di riferimento di 60 Nm, 160 Nm, e 1 mm.

Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

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