Isolement mitochondriale du muscle squelettique

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Biology

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Summary

Ce protocole décrit une procédure pour étudier la respiration des mitochondries isolées de muscles squelettiques. Cette méthode a été adaptée à partir Scorrano

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Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (49), e2452, doi:10.3791/2452 (2011).

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Abstract

Les mitochondries sont des organites le contrôle de la vie et la mort de la cellule. Ils participent à des réactions métaboliques clés, synthétiser plus de l'ATP, et de réglementer un certain nombre de cascades de signalisation 2,3. Les chercheurs actuels et passés ont mitochondries isolées à partir des tissus de rats et de souris, comme le foie, le cerveau et le coeur 4,5. Ces dernières années, de nombreux chercheurs se sont concentrés sur l'étude de la fonction mitochondriale des muscles squelettiques.

Ici, nous décrivons une méthode que nous avons utilisé avec succès pour l'isolement des mitochondries des muscles squelettiques 6. Notre procédure exige que tous les tampons et les réactifs sont frais et ont besoin d'environ 250-500 mg de muscle squelettique. Nous avons étudié les mitochondries isolées de rat et de souris gastrocnémien et le diaphragme et les muscles extraoculaires chez le rat. Concentration de la protéine mitochondriale est mesurée avec le dosage de Bradford. Il est important que les échantillons mitochondriale être conservés glacée pendant la préparation et que des études fonctionnelles être effectuée dans un temps relativement court (~ 1 h). Respiration mitochondriale est mesurée en utilisant la polarographie avec une électrode de type Clark (système oxygraphe) à 37 ° C 7. Calibrage de l'électrode à oxygène est une étape clé dans ce protocole et elle doit être effectuée quotidiennement. Mitochondries isolées (150 ug) sont ajoutés à 0,5 ml de tampon expérimental (EB). Etat 2 la respiration commence avec l'ajout de glutamate (5mm) et malate (2,5 mM). Ensuite, l'adénosine diphosphate (ADP) (150 uM) est ajouté pour commencer l'état 3. Oligomycine (1 pM), un bloqueur synthase ATPase, est utilisé pour estimer l'état 4. Enfin, le cyanure de p-carbonyle [trifluorométhoxy]-phényl-hydrazone (FCCP, 0,2 M) est ajouté à measurestate 5, ou la respiration découplée 6. Le ratio de contrôle respiratoire (RCR), le ratio de l'état 3 à l'état 4, est calculé après chaque expérience. Un RCR ≥ 4 est considéré comme une preuve d'une préparation viables mitochondries.

En résumé, nous présentons une méthode pour l'isolement des mitochondries viables à partir des muscles squelettiques qui peuvent être utilisés dans biochimiques (par exemple une activité enzymatique, immunodétection, protéomique), des études et fonctionnels (respiration mitochondriale).

Protocol

1. Préparation des tampons

  1. Allumez 5804R centrifugeuse et fixé à 4 ° C. Tourner sur le bain d'eau Isotemp 3006D et mettre à 37 ° C.
  2. Préparer les solutions suivantes avant l'isolement du muscle:
    • PBS: dissoudre tampon phosphate salin (PBS) comprimés dans de l'eau distillée (5 comprimés / litre). Mélangez bien.
    • PBS + 10 mM EDTA: Pour préparer une solution de 100 ml, ajouter 2 ml d'EDTA 500 mM à 98 ml de PBS.
    • 8X tampon Mitochondries: 10,28 g de saccharose pour une concentration finale de 0,6 M, 400 mg d'acides gras libres de sérum albumine bovine (BSA) pour une concentration finale de 0,8%, 2,08 g d'HEPES pour une concentration finale de 160 mM, pH à 7,4 et QS à 50 ml d'eau distillée.
    • Une mémoire tampon d'isolement (IB1): Ajouter 200 ul d'EDTA 500 mM pour une concentration finale de 10 mM, 0,392 g de D-mannitol pour une concentration finale de 215 mM, 1,25 ml de 8X, pH à 7,4 mitochondries et QS à 10 ml d'eau distillée.
    • 2 tampons Isolement (IB2): Ajouter 60 ul de 500 mM EGTA pour une concentration finale de 3 mM, 0,392 g de D-mannitol pour une concentration finale de 215 mM, 1,25 ml de 8X, pH à 7,4 mitochondries et QS à 10 ml d'eau distillée.
    • Tampon expérimental (EB): Ajouter 100 ul de 500 mM de MgCl 2 pour une concentration finale de 5 mM, 0,392 g de D-mannitol pour une concentration finale de 215 mm, 25 pl de 2,5 mM KH 2 PO 4 pour une concentration finale de 6,25 uM, 2 pl de 100 mM EGTA pour une concentration finale de 20 uM, 1,25 ml de tampon mitochondrial, le pH à 7,4 et QS à 10 ml d'eau distillée.

2. Isolement du muscle

  1. Dans un seau à glace, mettre trois béchers 10 ml, broyeurs tissus Potter Elvehjem et tous les autres instruments nécessaires / fournitures sur la glace. Tout doit rester glacée toute l'expérience.
  2. Placez IB1 et IB2 dans un seau à glace et EB dans le bain d'eau chaude lorsque vous avez terminé.
  3. Dans les trois béchers 10 ml, les solutions suivantes doivent être ajoutées:
    • Bécher 1: 10 ml de PBS
    • Bécher 2: 10 ml de PBS / EDTA
    • Bécher 3: 3 ml de IB1
  4. Tuer un rat humainement approuvé par votre soin des animaux et du Comité institutionnel local utilisation.
  5. Isoler rapidement 250-500 mg de muscle squelettique, rincer dans le bécher 1, puis transfert à Bécher 2.

3. Homogénéisation / Isolement mitochondriale

  1. Transfert de muscle pour bécher de 3 et finement hachée le muscle avec des ciseaux.
  2. Transférer la solution dans l'homogénéisateur Potter-Elvehjem. Homogénéiser le muscle à l'aide d'un pilon motorisé (une perceuse va faire le travail) 10 fois gardant le tube dans la glace en tout temps.
  3. Transfert homogénat de pré-réfrigérée microtubes de 2 ml et centrifuger à 700 g pendant 10 minutes à 4 ° C.
  4. Transférer le surnageant dans un microtube de pré-réfrigérée nouvelle. Jeter granulés.
  5. Centrifuger le surnageant au 10500 g pendant 10 minutes à 4 ° C.
  6. Transférer le surnageant dans un microtube de pré-réfrigérée nouvelle et SN1 étiquette (numéro de surnageant 1) et le type de muscle.
  7. Re-suspendre le culot dans 500 ul de IB2.
  8. Centrifuger à 10500 g pendant 10 minutes à 4 ° C.
  9. Transférer le surnageant dans un microtube de pré-réfrigérée nouvelle et SN2 étiquette (numéro de surnageant 2) et le type de muscle.
  10. Suspendre finale mitochondriale culot dans 100 ul d'IB2.
  11. Re-spin suspension finale mitochondrial dans Minifuge pendant quelques secondes. S'il ya une boulette, le transfert surnageant dans un microtube de pré-réfrigérée nouveau et jeter le culot.
  12. Déterminer la concentration de protéines en utilisant le dosage de Bradford 8.

4. Étalonnage de l'électrode

REMARQUE: étalonnage de l'électrode complète lors de l'isolement des mitochondries.

  1. Ajouter 100 ml d'eau distillée à 250 ml flacon. Agiter vigoureusement pendant 20 minutes pour équilibrer l'eau avec du gaz dans l'atmosphère.
  2. Ajouter quelques gouttes de 50% de KCl à l'électrode oxygraphe.
  3. Placer un petit morceau de papier à rouler Rizla bleu sur le dessus de l'électrode.
  4. Placer un morceau de membrane en PTFE sur le dessus du papier à rouler.
  5. Appliquer la bague intérieure en utilisant l'applicateur anneau et ensuite placer la bague extérieure dans le sillon de l'électrode.
  6. Connectez-électrodes et montons le reste de l'équipement: plus grand anneau de plastique de base, la chambre des mitochondries, et les tuyaux d'eau.
  7. Mettez les boîtes oxygraphe et lancer le logiciel oxygraphe.
  8. Ajouter l'eau équilibrée à la chambre des mitochondries.
  9. Ajouter le barreau d'agitation et tourner à une vitesse de 60.
  10. Commencer une nouvelle expérience.
  11. Cliquez sur l'étalonnage et de calibration, puis en phase liquide pour l'encadré 1. Changement de température à 37 ° C et cliquez sur "OK" deux fois.
  12. Quand "Override" changements "OK" cliquer dessus et ouvrir le réservoir d'azote.
  13. Placez la pointe connectéau réservoir d'azote dans la chambre de l'oxygène et d'établir à zéro. Cliquez sur "OK" quand il passe de "neutralisation".
  14. Aspirer l'eau et ajouter 500 ul de tampon EB aux chambres mitochondriale.
  15. Chambre d'étanchéité avec le piston.
  16. Si vous utilisez plusieurs boîtes, répétez les étapes 11 à 15 pour l'étalonnage de l'encadré 2.

5. Respiration mitochondriale

  1. Démarrer une nouvelle expérience; le laisser fonctionner pendant environ 1 minute pour stabiliser le signal.
  2. Ajouter le volume nécessaire de la suspension mitochondriale (étape 3.11) pour 150 g dans chaque chambre, un événement marque, et le laisser tourner pendant 1 minute.
  3. Ajouter 10 ul d'eau tiède 250 mM glutamate mM/125 / malate pour une concentration finale de 5 mM mM/2.5. Mark et de laisser fonctionner pendant 1 minute. Ceci est défini comme l'État 2.
  4. Ajouter 7,5 ul de 10 mM d'ADP pour une concentration finale de 150 uM, marque, et laissez fonctionner pendant 30 secondes. Ceci est défini comme l'État 3.
  5. Ajouter un autre ul 7.5 de 10 mM d'ADP, marque, et laissez fonctionner pendant 1,5 minutes.
  6. Ajouter 0,5 ul de froid 10 mM oligomycine pour une concentration finale de 1 uM, marque, et laisser courir pendant 3 minutes. Ceci est défini comme l'État 4.
  7. Ajouter 1 ul de froid 0,1 mM FCCP pour une concentration finale de 0,2 uM, marque, et laisser courir pendant 3 minutes. Ceci est défini comme l'État 5.
  8. Lorsque vous avez terminé, fin expérimenter et sauver.
  9. Acquérir des taux de respiration en utilisant le logiciel oxygraphe.
  10. Entrez le facteur de normalisation: si l'ajout de 150 ug de protéine mitochondriale, le facteur de normalisation sera de 0,15.
  11. Calculer le taux de respiration normalisé pour les états de respiration différente.
  12. Calculer le rapport de contrôle respiratoire (RCR), en divisant l'État par État 3 4.

6. Les résultats représentatifs:

Figure 1
Figure 1. Montre un représentant de traçage de la consommation d'oxygène par les muscles squelettiques mitochondries. Après le signal de l'électrode est stabilisée, l'échantillon mitochondries est ajouté à la chambre oxygraphe. Etat 2 la respiration commence avec l'ajout de glutamate et le malate. Ajout d'ADP augmente la consommation d'oxygène, en définissant l'état 3 respiration. ATP synthase est bloquée par addition de oligomycine pour obtenir l'état 4 respiration. Enfin, FCCP est ajouté à découpler la respiration mitochondriale (état 5). Le tableau 1 montre les taux de consommation d'oxygène représentant des États-2, 3, 4 et 5. Le ratio de contrôle respiratoire (RCR) est calculé pour chaque expérience. RCR ≥ 4 est considéré comme une preuve d'une préparation viables mitochondries.

Etats

Tarifs normalisé

État 2

34,74

État 3

153,40

État 4

16,49

État 5

143,70

RCR

9,30

Tableau 1. Taux de respiration mitochondriale. Representativeoxygen taux de consommation du muscle squelettique mitochondries. Les valeurs sont normalisées à la quantité de mitochondries ajouté à la chambre. Le ratio de contrôle respiratoire (RCR) est déterminé en divisant l'état 3 par l'Etat 4. Un RCR ≥ 4 représente une préparation viables mitochondries.

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Discussion

Nous présentons un protocole pour isoler les mitochondries viables à partir des muscles squelettiques. Si le rendement est un problème, le protocole peut être modifié en incubant le muscle isolé dans 5 ml de trypsine EDTA/0.01% PBS/10mM pendant 30 minutes dans la glace. Pour assurer la digestion complète du muscle à la trypsine, le muscle doit être pleinement hachée. Après l'incubation de 30 minutes, la solution de trypsine PBS/10mM EDTA/0.01% doit être entièrement remplacé par 3 ml de tampon d'isolement 1 (IB1). En outre, l'utilisation de trypsine peuvent interférer avec certains substrats mitochondriaux au cours du protocole de respiration. Tous les substrats utilisés dans ce résultat de protocole dans de bonnes préparations mitochondriales en utilisant la trypsine.

Pour les muscles squelettiques de souris, il est préférable de combiner les muscles jumeaux des deux jambes, ou d'utiliser le diaphragme entier. Pour les muscles squelettiques chez le rat, une petite section du jumeau ou le diaphragme est suffisante. Masse musculaire excessive peut compliquer la procédure d'isolement et de faire baisser les rendements. Pour l'isolation des muscles très petits comme les muscles extraoculaires, il est nécessaire de muscles piscine de plus de 1 animal pour obtenir la masse musculaire nécessaire.

Ce protocole se réfère à deux surnageants différentes: SN1 et SN2. Ces surnageants sont le résultat de centrifugation différentielle et contiennent non mitochondriale des protéines. Les protéines à partir de ces surnageants et de la finale culot de mitochondries peuvent être utilisées dans des Western blots de vérifier la pureté de la préparation mitochondriale. Western blot utilisant des anticorps mitochondriaux et cytoplasmiques confirmer la pureté de votre préparation mitochondriale dans le culot final.

Nettoyage du matériel respiration mitochondriale est essentiel pour une expérience réussie. Après chaque expérience, les chambres doivent être soigneusement nettoyés comme suit: rincez les chambres à cinq reprises avec de l'eau distillée, rincer une fois avec 70% d'éthanol pour éliminer l'éthanol soluble substrats, rincer avec une solution saturée de PBS / BSA pendant environ 5 minutes, enfin, rincez chambres 5 fois avec de l'eau distillée. Type Clark électrodes doivent être bien nettoyés après chaque utilisation par un rinçage à plusieurs reprises avec de l'eau distillée et doucement frottés avec une brosse à dents. Ensuite, ils doivent être complètement séché avec prêté sans lingettes et stocké dans un dessiccateur. Une fois par semaine, les électrodes doivent être polies à l'aide du kit de polissage oxygraphe.

Substrats mitochondriaux sont préparés comme des solutions stock, aliquotés et conservés à -20 o C. Nous ne recommandons pas la ré-utilisation de substrats. Dans notre expérience, la plupart des substrats sont stables à -20 o C pendant plusieurs mois, sauf pour oligomycine qui doit être remplacé tous les 2 mois environ. Toujours se référer aux spécifications du fabricant pour plus de détails.

Enfin, ce protocole peut également être utilisé pour isoler les mitochondries du cœur. Comme pour les autres muscles, la taille de l'animal (rat vs souris) permettra de déterminer quelle fraction de l'organe est nécessaire d'obtenir des mitochondries suffisante.

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Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par une subvention de l'Institut national des yeux (R01 EY12998) à FH Andrade.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
95% CO2 / 5% O2 mix Local Gas Supplier
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt Sigma-Aldrich A2754
Blue Rizla Paper Hansatech 890101
Bradford protein assay Bio-Rad 500-0006
Carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) Sigma-Aldrich C2920
Centrifuge 5804R Eppendorf
Compressed nitrogen Local Gas Supplier
D-mannitol Sigma-Aldrich M9647
Ethlyene-glycol-bis-tetraacetic acid (EGTA) Sigma-Aldrich E3889
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Bio-Rad 161-0728
Free fatty acid bovine serum albumin Sigma-Aldrich A8806
Glutamic acid Sigma-Aldrich G5889
HEPES sodium salt Sigma-Aldrich H7006
Isotemp 3006D Fisher Scientific
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Male Sprague Dawley Rats Harlan Laboratories 300-500g
Malic acid Sigma-Aldrich M9138
Minifuge ISC Bioexpress C1301P
Oligomycin Sigma-Aldrich O4876
Oxygen electrode disc Hansatech S1
Oxygraph Hansatech
Oxygraph Plus V1.01 Software Hansatech
pH-meter Mettler Toledo 1225506149
Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417
Potassium chloride Sigma-Aldrich P3911
Potassium phosphate Sigma-Aldrich P8416
Potter-Elvehjem homogenizers Fisher Scientific 08-414-14A
PTFE (0.0125mm × 25mm) membrane Hansatech S4
SKIL 3320 drill press Hardware store
Sucrose Sigma-Aldrich S5016

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References

  1. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2, 287-295 (2007).
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  8. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).

Comments

1 Comment

  1. I'm sorry, I don't typically feel the need to interject, but I feel that the information in this protocol is lacking and at times inaccurate. While the buffers and general protocol are by and large correct, following the procedures shown in the video will yield low State 3 rates and the absence of a true "State 4," without the addition of oligomycin. While it is true that State 4 rates in the literature are generally reported in the presence of oligomycin, the absence of a progression to State 4 as described by Chance and Williams in 1955 indicates swollen, broken, leaky mitochondria and a poor preparation. Furthermore, State 5 here is described as after FCCP addition, which is in reality a modified State 3, sometimes called as "State 3U", or State 3 Uncoupled, as described in a letter by John Lemasters. State 5 is actually characterized by the absence of oxygen in the reaction chamber, and therefor a very low oxygen consumption rate.

    Reply
    Posted by: Dieter K.
    March 6, 2013 - 8:08 PM

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