Risposte di misura della luce circadiani e acuta nel topo, utilizzando attività ruota corsa

Published 2/04/2011
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Neuroscience

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Summary

Questo articolo esamina i metodi che possono essere utilizzati per determinare la funzione circadiani e la reattività della luce nei topi.

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LeGates, T. A., Altimus, C. M. Measuring Circadian and Acute Light Responses in Mice using Wheel Running Activity. J. Vis. Exp. (48), e2463, doi:10.3791/2463 (2011).

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Abstract

Ritmi circadiani sono funzioni fisiologiche che il ciclo in un periodo di circa 24 ore (circadiani-circa: approssimativa e diem: giorno) 1, 2. Essi sono responsabili di timing nostro sonno / veglia e cicli di secrezione ormonale. Dal momento che questo tempo non è esattamente di 24 ore, è sincronizzato con il giorno di ingresso della luce solare. Questo si realizza tramite l'ingresso fotica dalla retina al nucleo soprachiasmatico (SCN) che funge da pacemaker maestro sincronizzazione degli orologi periferici in altre regioni del cervello e dei tessuti periferici al ambientale del ciclo di luce oscura 3-7. L'allineamento dei ritmi di questa ambientale del ciclo di luce oscura particolare organizza eventi fisiologici alla nicchia corretta temporale, che è cruciale per la sopravvivenza 8. Per esempio, i topi dormire durante il giorno e sono attivi di notte. Questa capacità di consolidare l'attività sia alla porzione chiaro o scuro della giornata viene indicato come photoentrainment circadiani e richiede ingresso luce per l'orologio circadiano 9. Attività di topi di notte è particolarmente robusta in presenza di una ruota in esecuzione. La misurazione di questo comportamento è una metodica minimamente invasiva che può essere utilizzato per valutare la funzionalità del sistema circadiano così come ingresso la luce a questo sistema. I metodi che verranno trattati qui sono utilizzati per esaminare l'orologio circadiano, inseriti luce a questo sistema, così come l'influenza diretta della luce sul comportamento della ruota in esecuzione.

Protocol

1. Attrezzature installazione

  1. Preparazione di gruppi di animali è molto importante quando si imposta qualsiasi esperimento comportamentale. Per l'attività ruota corsa, tutti i topi devono essere di sesso maschile, stessa età, e se possibile da accoppiamenti tra fratelli. Idealmente topi più giovani, circa 3 mesi di età, sono utilizzati per l'attività ruota portante.
  2. Prima di mettere gli animali su ruote, la sala deve essere completamente impostazione. Questo include la predisposizione ogni gabbia con 1 ruota, 1 ruota rivoluzione sonda, una piccola quantità di biancheria da letto del mouse nella parte inferiore di ogni gabbia e cibo in abbondanza e acqua per 2 settimane.
  3. L'illuminazione è molto importante, durante l'impostazione della ruota gabbie in esecuzione, è importante misurare l'intensità della luce in ogni gabbia per verificare che hai trovato anche l'illuminazione in ogni gabbia. Inoltre, quando si sceglie una fonte di luce, cercare uno con un ampio spettro che copre 450nm-650nm. Molte aziende offrono "luce diurna" o "spettro completo" lampade a fluorescenza, che soddisfano questo criterio. (Vedi Figura 1)

2. Esperimento installazione

  1. Nell'introdurre i topi in gabbia ruota portante, farlo in un ciclo di luce che corrisponde da vicino il ciclo luce / buio erano precedentemente alloggiati sotto.
  2. Cercate di distribuire uniformemente i topi per garantire una migliore ambienti simili per tutti i gruppi. Per esempio, astenersi da ogni raggruppamento di un gruppo di topi in una zona particolare come un singolo scaffale. Questo potrebbe inavvertitamente introdurre una variabile aggiuntiva.
  3. Prima di effettuare qualsiasi alterazioni del ciclo luce o la misurazione dell'attività, si dovrebbe dare topi circa una settimana per acclimatarsi alla nuova gabbia, e la ruota. Qualsiasi topi che non eseguono sulle ruote dopo una settimana dovrebbe essere tolto dalla gabbia e sostituito con un altro mouse.
  4. Una volta che hai una coorte di animali stabilmente motore, su ruote, è possibile avviare la creazione di cicli di luce / buio per verificare ipotesi diverse. I cicli di luce diversi sono discussi in dettaglio nella parte 3.

3. Saggi sperimentali

  1. Per photoentrainment saggio, iniziare dai topi alloggio in una luce h 12: 12 h ciclo scuro. Un esempio di questo sarebbe luci accese dalle 7:00 am-7: 00pm, mentre le luci rimangono fuori da 19:00-7:00. Inoltre, abbassando l'intensità della luce per la quota di 12 h luce del ciclo esporrà eventuali differenze di sensibilità alla luce per photoentrainment. I topi devono essere date due settimane per photoentrain e prima di cambiare intensità di luce. (Figura 2)
  2. Un aspetto ulteriore photoentrainment è la capacità di ri-regolazione o ri-sincronizzare i ritmi circadiani di una nuova luce / buio ciclo. Questo può essere esaminato da avanzare il ciclo luce / buio che i topi sono alloggiati in modo che le luci si accendono e si spengono prima. Comunemente, i cicli di luce sono avanzati di 6 ore, per esempio, invece di un ciclo di luce di 7:00 am-7: 00pm, sarebbe 01:00-1: 12:00. Questo può anche essere esaminato ritardando il ciclo di luce. I topi sono generalmente in grado di ri-salire sul treno in 5-7 giorni. (Figura 3)
  3. Questi paradigmi non sono, tuttavia, valutare pienamente la funzionalità dell'orologio endogeno circadiano. Ospitano topi in condizioni di buio costante può essere usata per misurare il periodo circadiano endogeno anche conosciuto come il periodo free running. Negli animali notturni come i topi wild-type, il periodo endogena è meno di 24 ore il che significa che si comincia in esecuzione su la ruota un po 'prima ogni giorno. (Figura 2) L'ora esatta di questo periodo varia leggermente tra i diversi ceppi di topi. Ad esempio, il periodo gratuito esecuzione di topi C57 è di circa 23,3 ore mentre in BALB / cJ topi che è di 22,5 ore 10.
  4. Dopo aver determinato il periodo di free running in costante buio luce le condizioni di ingresso al sistema circadiano possono essere esaminate attraverso sfasamento. Sfasamento è la capacità di un impulso di luce acuta di spostare l'orologio circadiano. Sfasamento può essere ottenuto con la somministrazione di un breve impulso di luce (15 minuti; 1000lux) durante la fase attiva di topi all'interno di buio costante e misurare l'inizio di attività nei seguenti giorni questo impulso luminoso. (Figura 4) Studi precedenti hanno prodotto le curve di risposta (definita curve di risposta di fase) che descrivono la quantità e la direzione di spostamento in base a quanto tempo la luce è data 11, 12. Per esempio, a 15 minuti, 1000 lux luce pulsata data 4 ore dopo l'inizio di attività (CT16) porterà ad un ritardo di 2 ore in attività, mentre l'impulso luminoso stessa data 8 ore dopo l'inizio di attività (CT20) porterà ad un anticipo di 2 ore. (Figura 4)
  5. Per verificare l'effetto diretto della luce sulle attività ruota corsa, un impulso di luce può essere somministrato a topi durante il buio / attivo di fase. La presenza di luce in questo momento inibisce ruote in esecuzione di attività. Mentre la lunghezza di questo impulso di luce può variare, abbiamo scoperto che 3 ore di impulso iniziale 2 ore dopo l'inizio della fase oscura è più informativo. (Figura 5) In alcuni casi, può essere utile per consolidare l'attività prima di questo test, si può facilmente fare ciò modificando il ciclo di luce ad una luce 16 h: 8 h ciclo buio una settimana prima della somministrazione degli impulsi di luce.
  6. Questa inibizione della ruota portante attività direttamente dalla luce può essere esaminata in tutte le fasi del ciclo circadiano utilizzando un (T7) ciclo di luce ultradiani 13. Questo ciclo è composto di 3,5 ore di luce: 3,5 scuro h per la durata di 1 settimana 13. I topi non sono in grado di permettere photoentrain impulsi di luce di cadere in tutti i punti del ciclo circadiano nel corso di questo 1 settimana di trattamento. (Figura 6)
  7. Simile a condizioni di buio costante, ospitano topi in luce costante rivelerà una caratteristica periodo di free running. Tuttavia, questo periodo sarà più lungo del periodo si trovano in oscurità costante. La durata del periodo di free running a luce costante è positivamente correlata con l'intensità della luce 14, come la quantità di luce aumenta così fa la lunghezza libera periodo di esecuzione. (Figura 7) Tuttavia, i topi raramente mostrano periodi superiori a 26 ore. Invece, in piena luce, la loro attività diventa aritmico. Per questo motivo, è l'intensità della luce è un fattore importante se si prevede di confrontare la lunghezza del periodo di luce costante.
  8. Al momento di decidere l'ordine con cui eseguire queste perturbazioni luce, ricordare che i cicli precedenti la luce può influenzare i ritmi circadiani. Per questo motivo, è meglio iniziare con il più mite primi trattamenti e progressivamente passare a trattamenti più luce gravi. Per esempio, saggi photoentrainment, scuro costante, e spostamenti di fase sono tutte molto lievi e non sembrano portare ad effetti di lunga durata. D'altra parte, il ciclo di T7 e luce costante sono trattamenti luce molto duro e può portare ad aritmie e dovrebbe essere riservato per la fine dell'esperimento.

4. Analizzando i dati

  1. Ruote in esecuzione di attività vengono raccolte e il numero di giri della ruota che si verificano entro un determinato periodo di tempo cestinate. Questo intervallo di bin o di campionamento è comunemente di 10 minuti. I dati possono essere visualizzati in un foglio di calcolo Excel che mostra il numero di giri della ruota all'interno di ogni bin. Questo può essere utile per quantificare e confrontare giri della ruota. I dati possono anche essere visualizzati come un actogram in cui è rappresentata la quantità di attività in ogni bin per l'altezza di una barra nera come un istogramma. (Figura 2)
  2. Inizio attività è definito come l'inizio del l'incontro attività predominanti. I parametri esatto può variare tra ogni individuo, ma in generale, cerchiamo il primo periodo di attività che si protrae per più di 30 minuti.
  3. Per analizzare la capacità dei topi di photoentrain, ci sono varie misure che possono essere guardati. Un metodo comunemente usato per considerare un mouse per essere photoentrained è l'osservazione di un rapporto stabile tra l'inizio dell'attività del mouse e la compensazione della luce così come una grande percentuale di attività del mouse limitandosi alla fase di buio.
  4. L'inizio dell'attività fornisce la maggior parte delle informazioni cercando di re-trascinamento di un anticipo del ciclo luce / buio, mentre l'attività offset è più informativa in sede di esame re-trascinamento dei ritardi nella ciclo luce / buio. I topi di solito 5-7 giorni per prendere completamente ri-sincronizzare le loro attività ruota portante a 6 ore di anticipo o ritardo del ciclo luce / buio. Per considerare un mouse ri-trascinato, in particolare in risposta ad un anticipo, si dovrebbe osservare una relazione stabile tra l'inizio dell'attività e la luce offset. Questo rapporto dovrebbe essere simile a quanto osservato prima del ciclo di luce anticipo e deve persistere per almeno tre giorni. (Figura 3)
  5. Per calcolare il periodo buio sia luce costante e costante, le insorgenze di attività devono essere determinati per 2 settimane e dotato di una retta di regressione. Come accennato in precedenza, nei topi wild-type, il periodo buio in costante sarà meno di 24 ore durante il periodo in luce costante sarà maggiore di 24 ore. (Figure 2 e 7)
  6. Quando si calcola lo spostamento a seguito di un impulso di luce, iniziare da linee di regressione opportuno insorgenze attività per almeno 5 giorni prima e 5 giorni dopo l'impulso luminoso. Calcolare la differenza tra queste due linee di regressione per determinare l'entità del cambiamento di fase. (Figura 4)

5. Rappresentante Risultati

Se si guarda alla ruota record in esecuzione, si dovrebbe aspettare di vedere diverse ore di funzionamento continuo in ogni mouse. Poiché i topi sono animali notturni, questa esecuzione, o fase attiva, si correlano con il periodo buio in presenza di un ciclo luce / buio. I topi senza esecuzione in condizioni costanti avrà anche questo periodo di attività confinate sostenuto che rappresenta la fase attiva del loro free-running ritmo. Nel buio costante, questa sarà più breve di 24 ore e alla luce costante,superiore a 24 ore. La somministrazione di 15 minuti di luce pulsata 1000lux 4 ore dopo l'inizio di attività (CT16) si tradurrà in ritardo inizio attività nei seguenti giorni questo impulso luminoso.

Figura 1
Figura 1: spettro di luce Rappresentante A.. Lo spettro della luce prodotta dal sole è ampia e relativamente imparziali tra 400nm e 700nm, che è la parte visiva dello spettro luminoso. B. Lo spettro di una luce incandescente picchi nella gamma degli infrarossi, il che porta alla sua polarizzazione rosso, con bassa intensità nella gamma del blu. C. Il bulbo fluorescente tipico, composto da discreti picchi di luce che apparirà "bianco" per l'occhio. D. Tuttavia, le lampadine fluorescenti luce hanno uno spettro più ampio e picchi di frequenza discrete. Il risultato è una fonte di luce che non è caldo come una lampadina ad incandescenza, ma ha uno spettro più ampio rispetto a una lampadina a fluorescenza media.

Figura 2
Figura 2: photoentrainment circadiani. Il actogram è un grafico di attività da un mouse unico nel quale sono tracciate giorni consecutivi l'asse y, e il tempo è tracciata sulla asse delle ascisse. Le barre nere rappresentano il numero di giri delle ruote, e lo sfondo è sfumato per dare un'indicazione del ciclo luce / buio. Nei giorni 1-8, il mouse si trova in un 12:12 luce: ciclo scuro. Durante questo tempo, il mouse si avvia alla compensazione di luci e consolida la sua attività alla fase di buio. Durante la fase di luce, l'attività è minima. Il giorno 9, le luci sono spente, lasciando il mouse nel buio costante. Senza un ciclo di luce, non c'è nessun ingresso per l'orologio circadiano, che si traduce nel tempo in esecuzione sul proprio tempo endogene. Come potete vedere, l'attività inizia prima giornata l'indicazione che l'orologio endogeno di questo animale è inferiore a 24 ore.

Figura 3
Figura 3: Re-trascinamento. Re-trascinamento paradigmi coinvolgere spostando il ciclo di luce in avanti o indietro costringendo l'orologio circadiano per regolare al ciclo di nuova luce. In questo esempio, il ciclo è avanzato 6 ore il giorno 9 e poi ritardato 6 ore il giorno 20. In entrambi i casi, alcuni giorni sono necessari per la piena re-trascinamento, tuttavia a seconda della direzione del movimento l'effetto è più pronunciato in entrambi l'insorgenza o orario.

Figura 4
Figura 4: ritmi circadiani spostamento in risposta a brevi impulsi di luce. A. Gli animali ospitati nel buio costante free-run con un periodo più breve di 24 ore. Al giorno 8, a 15 minuti a 1000-lux luce pulsata viene data 4 ore dopo l'inizio di attività (CT16). Nei giorni successivi, uno spostamento nel tempo attività di inizio viene osservato. Il cambiamento di fase è la differenza di tempo di inizio previsto dell'animale (determinata dalla loro attività prima l'impulso luminoso) e il tempo che in realtà inizia a decorrere il giorno seguente l'impulso luminoso.
B. La curva di risposta di fase per i topi mostra la quantità e la direzione del cambiamento che si verifica in risposta ad un impulso di luce a breve specifiche volte circadiano. Un impulso di luce durante il giorno soggettivo (CT0-12) non può indurre un cambiamento significativo, denominata la zona morta. Da CT12-19, un ritardo di fase può essere indotta con il ritardo di picco che si verificano in risposta ad un impulso di luce in CT16. Tra TC 19 e 24, il ritmo dell'attività avanzerà in risposta ad un impulso di luce con l'anticipo di punta si verificano in risposta ad un impulso di luce in CT20.

Figura 5
Figura 5: ruote in esecuzione di attività è inibita o mascherati in risposta ad un impulso di luce durante la notte. In questo esempio, il ciclo di luce è 16h luce: buio 8h e consolida l'attività. A 3 ore impulso di luce inizia 2 ore dopo le luci si spengono il giorno 4. Durante questo periodo, c'è poco da non ruota in esecuzione di attività che mostra la capacità della luce di inibire direttamente l'attività. Riprende l'attività dopo l'impulso luminoso.

Figura 6
Figura 6: T7 ciclo di luce è utilizzato per esporre i topi di impulsi di luce per tutto il ciclo circadiano. Il ciclo di T7 è costituito da 3,5 ore di luce seguito da 3,5 ore di buio. In questo ciclo, i topi manterrà un ritmo circadiano, però possono anche visualizzare mascheramento di attività ruota in esecuzione durante gli impulsi di luce. La quantità di attività durante la luce può essere paragonato alla quantità di attività durante il buio per una misura di mascheramento, che non è influenzato dal tempo circadiano.

Figura 7
Figura 7: Periodo allungamento a luce costante

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Discussion

Ritmi circadiani sono stati misurati e registrati in vari organismi nel corso della storia. Mentre abbiamo specificamente descritto il metodo per la registrazione ritmi attività nei topi, questa tecnica può essere facilmente modificato per misurare ritmi di altri roditori come criceti e topi, che sono spesso utilizzati negli studi circadiano. Tuttavia, il periodo freerunning e il tempo per ri-salire sul treno in altri organismi può variare. Per esempio, il periodo freerunning di un criceto nel buio costante è 24,0 ore, mentre nei topi è meno di 24 ore. Nella circostanza, che si sta lavorando in un organismo, che non è adatto per l'attività ruota corsa, molti dei paradigmi stessa luce può essere utilizzato, tuttavia un ritmo diverso fisiologico indicato dovrebbe essere guardato. La misura più simile è l'attività in generale. Negli esseri umani, scimmie e cani, i ricercatori usano spesso actigrafia, che misura la quantità di movimento della persona. Negli esseri umani, la temperatura corporea e la secrezione di melatonina sono anche comunemente misurati e hanno entrambi dimostrato di avere un ritmo circadiano, che è in grado di sfasamento e in grado di ri-salire sul treno 15, 16.

Mentre pensiamo a questi ritmi fisiologici come eventi discreti, sono molto interconnessi. Il ritmo l'attività di un animale può essere sovrapposto a stretto contatto con il ritmo della temperatura corporea ed è l'inverso di un ritmo sonno. Inoltre, la secrezione di melatonina che viene spesso utilizzato come marcatore della fase circadiana, ricorda da vicino il ritmo sonno normale nell'uomo. Dato che questi cicli sono così intrecciate, lo studio di una possibile informare e prevedere i risultati di altri. Per esempio, NPAS2 topi mutanti, che ha mostrato ruota funzionamento continuo anche se l'attività fuori la parte oscura di un ciclo di luce scura, sono stati successivamente esaminati per difetti di sonno 17. Questi topi sono stati trovati a dormire meno complesso, con la diminuzione che si verificano durante la fase di buio, la normale "tempo pisolino".

Attività ruota portante fornisce un modo relativamente non invasivo per esaminare i ritmi circadiani. I paradigmi sopra descritti possono essere utilizzati per completare un'analisi dettagliata del comportamento circadiano. Inoltre, i paradigmi come photoentrainment e l'alloggio nel buio costante può essere utilizzata come un primo censimento dei fenotipi circadiano prima di ulteriori ricerche concentrate come l'analisi del sonno.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione NIH R01 GM76430, Lucille e David Packard Foundation e l'Alfred Sloan Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
11.5 cm running wheels Mini Mitter
Vital View Software for Data Acquisition Mini Mitter
Clock lab for data analysis Actimetrics

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References

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